ข้อมูล

การทำความสะอาดเพลท PCR แบบเรียลไทม์

การทำความสะอาดเพลท PCR แบบเรียลไทม์



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

มีใครเคยใช้ Realtime PCR บ้างมั้ยคะ ว่าเพลทของ realtime PCR เป็นแบบใช้ครั้งเดียวหรือเปล่า ? มิฉะนั้นจะทำความสะอาดจานหลังจากปฏิกิริยาเพื่อป้องกันผลผิดพลาดในครั้งต่อไปโดยใช้ ?


วิธีแก้ปัญหาที่เป็นไปได้คือการใช้ DNA ZAP ซึ่งผมรู้ว่าหลายคนใช้ในห้องทดลองที่อยู่ติดกัน และพอใจกับการทำความสะอาดโต๊ะทำงานที่ปราศจากดีเอ็นเอ แผ่นผลิตภัณฑ์ระบุว่า

เมื่อ 500 ng ของแม่แบบ DNA ถูกทำให้แห้งในหลอด PCR จะทำให้ไม่สามารถขยายสัญญาณได้เมื่อทำการบำบัดด้วย DNA ZAP โซลูชั่น การทดลองเพิ่มเติมแสดงให้เห็นว่า DNA ถูกย่อยสลายเป็นนิวคลีโอไทด์อิสระ

โปรดทราบว่าฉันไม่ได้โปรโมตผลิตภัณฑ์ใดๆ ที่นี่ และคุณสามารถซื้อผลิตภัณฑ์/เทคโนโลยีที่คล้ายคลึงกันสำหรับแอปพลิเคชันเฉพาะของคุณได้ อย่างชัดเจน คำแนะนำที่ดีที่สุดคือการใช้เพลตใหม่สำหรับแต่ละปฏิกิริยา แต่ผลิตภัณฑ์นี้/หรือผลิตภัณฑ์ที่คล้ายคลึงกันก็เป็นตัวเลือกได้เช่นกัน แม้ว่าความเสี่ยงของการปนเปื้อนของดีเอ็นเอในปฏิกิริยาจาก PCR ควรจะสมดุลอย่างระมัดระวังกับการใช้เพลตที่สดใหม่โดยพิจารณาว่าตัวผลิตภัณฑ์เองก็ไม่ฟรีเช่นกัน

แผ่นงานผลิตภัณฑ์มีคำแนะนำสำหรับการทำความสะอาด/การรักษาหลอด PCR ดังนั้นฉันคิดว่าคุณใช้โปรโตคอลเดียวกันสำหรับเพลต หากคุณมีเครื่องหมุนเหวี่ยงแบบจานที่มีอยู่ในห้องปฏิบัติการของคุณ คุณสามารถกำจัดสารละลายได้โดยการแตะแผ่นบนเนื้อเยื่อเพื่อเอาของเหลวออกจากบ่อน้ำ


คุณธรรมข้อหนึ่งที่อ้างสิทธิ์ของเพลต RT-PCR คือการไม่สามารถจับ DNA ได้ (ดูตัวอย่างการแบ่งประเภทได้ที่ http://www.fisher.co.uk/product/brand_listing.php/T/Thermo%20Scientific%20ABgene/PCR%20plate ) ดังนั้น สิ่งที่คุณต้องทำเพื่อกำจัด DNA (จีโนม แอมพลิฟายเออร์ หรือไพรเมอร์) ก็คือการล้าง DNA ออก นี่แสดงให้เห็นว่าการล้างอาจใช้ได้กับ dNTP

ในทางกลับกัน แผ่น RT-PCR หลายประเภททำจากโพลีคาร์บอเนตซึ่งสามารถจับโปรตีนได้ ฉันจะกังวลเกี่ยวกับปริมาณพอลิเมอเรสที่เกาะติดบ่อน้ำไม่สม่ำเสมอ ในการหลีกเลี่ยงปัญหานั้น คุณควรใช้ซ้ำในเพลต PCR ใดๆ ก็ตาม เฉพาะบ่อที่เคยเลื่อยโพลีเมอเรสมาก่อนเท่านั้น

ฉันไม่รู้ว่าโมเลกุลอื่นจับกับบ่อน้ำหรือไม่ แต่น่าจะตกอยู่ที่ DNA หรือกระบวนทัศน์ของโปรตีน

คุณจะเสียค่าใช้จ่ายเพียงหนึ่งเพลตและรีเจนท์สำหรับปฏิกิริยาเพียงสี่ปฏิกิริยาเพื่อทดสอบว่าเพลตเหล่านี้สามารถนำกลับมาใช้ใหม่ได้หรือไม่ ในการรันครั้งแรก ให้วัดสองตัวอย่าง A และ B สำหรับการถอดเสียงบางส่วน ล้างบ่อน้ำและวัดตัวอย่าง A และ B อีกครั้ง หากอัตราส่วนการถอดเสียง A/B แตกต่างกันอย่างมากระหว่างการพยายามครั้งแรกและครั้งที่สอง คุณรู้ว่าคุณไม่สามารถนำกลับมาใช้ใหม่ได้ ฉันจะกังวลด้วยว่าจะต้องใช้อีกหลายๆ รอบกว่าจะถึงขั้นที่ราบสูงในการพยายามครั้งที่สองหรือไม่ ผ่านการทดสอบเหล่านี้คุณอาจพร้อมแล้ว หากไม่ผ่านการทดสอบ คุณอาจยังคงใช้บ่อน้ำที่เหลืออยู่ได้ แจ้งให้เราทราบ.


6 วิธีในการลดการปนเปื้อนระหว่าง PCR . ให้น้อยที่สุด

ลักษณะที่ละเอียดอ่อนของ PCR ช่วยให้นักวิทยาศาสตร์สามารถแยกและขยายโปรไฟล์ DNA ที่เป็นประโยชน์ได้ อย่างไรก็ตาม ความไวในระดับสูงนี้อาจสร้างปัญหาได้เช่นกัน เนื่องจากเทมเพลตที่ไม่ถูกต้องสามารถขยายได้ ในรายการบล็อกนี้ เราจะสำรวจเคล็ดลับบางประการที่ควรคำนึงถึงเพื่อรวมไว้ในโปรโตคอลของเรา

  • 1. บทนำ
  • 2) การก่อสร้างห้องปฏิบัติการ
  • 3) เวิร์กโฟลว์ทิศทางเดียว
  • 4) เทคนิคการปิเปต
  • 5) เปลี่ยนถุงมือบ่อยๆ
  • 6) เทคนิคการทำความสะอาดปลอดเชื้อ
  • 7) รวมการควบคุมในโปรโตคอลของคุณ

1. บทนำ

การศึกษาการแสดงออกของยีนในเซลล์หรือเนื้อเยื่อในช่วงเวลาหนึ่งทำให้เข้าใจถึงความสามารถของเซลล์ในการสังเคราะห์โปรตีน การวิเคราะห์การแสดงออกของยีน ตัวอย่างเช่น การทำโปรไฟล์ของยีน เป็นเครื่องมือที่สำคัญและใช้กันอย่างแพร่หลายในการศึกษาความเป็นพิษระดับนาโน มีหลายวิธีในการกำหนดการแสดงออกของยีน เช่น การวิเคราะห์ Northern blot, การทดสอบการป้องกันไรโบนิวคลีเอส (RPA), การวิเคราะห์แบบอนุกรมของการแสดงออกของยีน (SAGE), ปฏิกิริยาลูกโซ่การถอดรหัสแบบย้อนกลับ-โพลีเมอเรส (RT-PCR), ห่วงโซ่โพลีเมอเรสแบบเรียลไทม์เชิงปริมาณ ปฏิกิริยา (qRT-PCR), อาร์เรย์ PCR และไมโครอาร์เรย์ ในบรรดาเทคนิคเหล่านี้ การวิเคราะห์ Northern blot ยังคงเป็นวิธีมาตรฐานสำหรับการตรวจจับและการหาปริมาณของระดับ mRNA แม้ว่าจะมีเทคนิคที่มีประสิทธิภาพมากกว่าก็ตาม Northern blotting เกี่ยวข้องกับการใช้อิเล็กโตรโฟรีซิสเพื่อแยกตัวอย่าง RNA ตามขนาด จากนั้นตรวจจับ mRNA ด้วยโพรบไฮบริไดเซชันที่เสริมเป็นส่วนหนึ่งของลำดับเป้าหมาย RPA เป็นเทคนิคที่มีความละเอียดอ่อนอย่างยิ่งในการหาปริมาณ RNA จำเพาะในสารละลาย สามารถทำได้บน RNA ของเซลล์ทั้งหมดหรือ mRNA ที่เลือกโพลี (A) เป็นเป้าหมาย วิธีการ SAGE เช่นเดียวกับอาร์เรย์ PCR และไมโครอาร์เรย์ ใช้เพื่อศึกษาการแสดงออกของยีนบางส่วนหรือทั่วโลกในเซลล์หรือเนื้อเยื่อในสภาวะการทดลองต่างๆ ในบทนี้ เราจะอธิบายวิธีการกำหนดการแสดงออกของยีนโดยใช้ RT-PCR และ PCR แบบเรียลไทม์ RT-PCR เป็นเครื่องมือที่ค่อนข้างง่าย ราคาไม่แพง มีความไวสูง และเฉพาะเจาะจงเพื่อกำหนดระดับการแสดงออกของยีนเป้าหมาย PCR แบบเรียลไทม์เป็นวิธีการเชิงปริมาณสำหรับกำหนดจำนวนสำเนาของแม่แบบ PCR เช่น DNA หรือ cDNA และประกอบด้วยสองประเภท: แบบใช้โพรบและแบบอินเทอร์คาเลเตอร์ PCR แบบเรียลไทม์ที่ใช้โพรบหรือที่เรียกว่า TaqMan PCR ต้องใช้ไพรเมอร์ PCR คู่หนึ่งและโพรบฟลูออโรเจนิกโอลิโกนิวคลีโอไทด์เพิ่มเติมที่มีทั้งสีย้อมเรืองแสงนักข่าวและสีย้อมดับ วิธีการแบบอิงตามอินเตอร์คาเลเตอร์ (SYBR Green) ต้องใช้สีย้อม DNA แบบสองสายใน PCR ซึ่งจับกับ DNA แบบสองสายที่สังเคราะห์ขึ้นใหม่และสร้างการเรืองแสง ทั้งสองวิธีต้องการเทอร์โมไซเคิลพิเศษที่ติดตั้งกล้องที่มีความละเอียดอ่อน ซึ่งจะตรวจสอบการเรืองแสงในแต่ละตัวอย่างเป็นระยะๆ ระหว่าง PCR เทคนิคหลักที่เป็นพื้นฐานของทั้ง RT-PCR และ PCR แบบเรียลไทม์ ได้แก่ การแยก RNA ทั้งหมด การถอดรหัสแบบย้อนกลับ (RT) และ PCR การถอดรหัสย้อนกลับเกี่ยวข้องกับการสังเคราะห์ DNA จาก RNA โดยใช้ DNA polymerase ที่ขึ้นกับ RNA PCR สามารถขยายสำเนา DNA หนึ่งชุดหรือสองสามชุดตามลำดับความสำคัญหลายระดับ สร้างสำเนาลำดับ DNA เฉพาะจำนวนหลายพันถึงล้านชุด เราจะแนะนำขั้นตอนโดยละเอียดสำหรับ RT-PCR และ PCR แบบเรียลไทม์


ส่วนท้าย

ข้อมูล

อื่น

Avantor ® ซึ่งเป็นบริษัทที่ติดอันดับ Fortune 500 เป็นผู้ให้บริการชั้นนำระดับโลกด้านผลิตภัณฑ์และบริการที่มีความสำคัญต่อภารกิจแก่ลูกค้าในอุตสาหกรรมยาชีวภาพ การดูแลสุขภาพ การศึกษาและรัฐบาล และเทคโนโลยีขั้นสูงและอุตสาหกรรมวัสดุประยุกต์ ผลงานของเราถูกใช้ในแทบทุกขั้นตอนของกิจกรรมการวิจัย การพัฒนา และการผลิตที่สำคัญที่สุดในอุตสาหกรรมที่เราให้บริการ จุดแข็งที่ยิ่งใหญ่ที่สุดประการหนึ่งของเรามาจากการมีโครงสร้างพื้นฐานระดับโลกที่ตั้งอยู่ในยุทธศาสตร์เพื่อรองรับความต้องการของลูกค้าของเรา รอยเท้าทั่วโลกของเราช่วยให้เราสามารถให้บริการลูกค้ามากกว่า 225,000 ที่ตั้งของลูกค้าและทำให้เราสามารถเข้าถึงห้องปฏิบัติการวิจัยและนักวิทยาศาสตร์ในกว่า 180 ประเทศได้อย่างกว้างขวาง เรากำหนดวิทยาศาสตร์เพื่อสร้างโลกที่ดีกว่า สำหรับข้อมูลเพิ่มเติม โปรดไปที่ www.avantorsciences.com และพบเราบน LinkedIn, Twitter และ Facebook

&คัดลอก 2021 VWR International, LLC. สงวนลิขสิทธิ์.
© 2021 FORTUNE Media IP Limited สงวนลิขสิทธิ์ ใช้ภายใต้ใบอนุญาต

เว็บไซต์นี้ไม่รองรับ Internet Explorer รุ่นของคุณ เราขอแนะนำให้คุณอัปเกรดเป็น Internet Explorer 11 หรือเบราว์เซอร์อื่นที่รองรับ และตรวจดูว่าคุณใช้ IE11 ใน โหมดมุมมองที่เข้ากันได้.


ปลดล็อกความเป็นไปได้

ระบบ MagNA Pure 24 ใหม่ ทำให้นิวคลีอิกบริสุทธิ์โดยอัตโนมัติด้วยความมั่นใจ

มิกซ์มาสเตอร์ของคุณอาจไม่ได้บอกเรื่องราวทั้งหมด

ขอความจริง. เรียกร้อง Evoscript

ยินดีต้อนรับสู่ยุคใหม่ของ Roche ภายใน Life Science

เราเฉลิมฉลองให้กับนักเรียน นักวิจัย ผู้จัดการที่ทำงานอย่างไม่รู้จักเหน็ดเหนื่อยในการแสวงหาการค้นพบ ด้วยการพัฒนาเครื่องมือและรีเอเจนต์ที่คุณพึ่งพาในแต่ละวัน เรามุ่งมั่นที่จะสนับสนุนความก้าวหน้าครั้งต่อไปของคุณ เพื่อให้คุณสามารถมุ่งความสนใจไปที่สิ่งที่คุณทำ: การค้นพบ

สร้างขึ้นเพื่อค้นหาเพิ่มเติม

นำ qPCR ของคุณไปสู่อีกระดับด้วย Multiplex Master Mixes เข้มข้น 5x ใหม่จาก Roche ตรวจจับเป้าหมายจำนวนมากขึ้นต่อปฏิกิริยา ทำงานอย่างมีประสิทธิภาพมากขึ้น และเพิ่มตัวอย่างที่มีค่าของคุณให้สูงสุด

LightMix Modular Assays

การออกแบบโมดูลาร์ LightMix Modular CE-IVD Assays ช่วยให้คุณสามารถสร้างแผงการตรวจจับเชื้อโรคที่เหมาะกับคุณ ไม่ว่าจะเป็นแบบ hexaplex หรือชุดทดสอบเดี่ยว LightMix Modular Assays กำลังเปลี่ยนกระบวนทัศน์สำหรับการตรวจหาเชื้อโรค การทดสอบทั้งหมดใช้โปรโตคอลมาตรฐานเดียวกันเพื่อสร้างผลลัพธ์ในสามขั้นตอนง่ายๆ

LightCycler ® 96 ระบบ

LightCycler ® 96 System เป็นโซลูชัน qPCR ที่มีปริมาณงานปานกลางสำหรับนักวิจัยเชิงวิชาการ โดยเป็นโซลูชันที่ใช้งานง่ายสำหรับประสบการณ์ทุกระดับ โดยให้การผสมผสานที่ลงตัวระหว่างความสม่ำเสมอของอุณหภูมิและความสามารถในการทำซ้ำของข้อมูล

วิธีใช้เวลาในห้องแล็บให้เกิดประโยชน์สูงสุด

ไม่มีอะไรจะดีไปกว่าความตื่นเต้นและความภาคภูมิใจที่มาพร้อมกับการทดลองที่ประสบความสำเร็จ และในขณะที่วิทยาศาสตร์ที่ดีเป็นแรงผลักดันเบื้องหลังความสำเร็จเหล่านี้อย่างแน่นอน แต่ไม่ควรมองข้ามความสามารถในการเพิ่มผลิตภาพและโอกาสในการประสบความสำเร็จสูงสุด เราทุกคนสามารถเกี่ยวข้องกับช่องว่างเวลาที่น่าอึดอัดใจเหล่านั้นได้เมื่อเจลของคุณกำลังทำงานหรือตัวอย่างของคุณกำลังล้างหรือฟักไข่ ในบทความนี้ เราจะแสดงรายการเคล็ดลับ 10 อันดับแรกในการเพิ่มผลผลิตในห้องปฏิบัติการของคุณให้สูงสุด

ระบบ MagNA Pure 96 ได้รับการออกแบบสำหรับขั้นตอนการทำงานที่เร่งขึ้น โดยได้รับการปรับให้เหมาะสมสำหรับการทำกรดนิวคลีอิกให้บริสุทธิ์ในปริมาณมาก โดยแยกตัวอย่าง 96 ตัวอย่างในเวลาน้อยกว่าหนึ่งชั่วโมง ซึ่งช่วยเพิ่มผลผลิตและลดข้อผิดพลาดในการจัดการได้อย่างมาก

แม่แบบเกี่ยวข้องกับอะไร?

ในบทความนี้ เราจะพูดถึงความสำคัญของการเริ่มต้นด้วยเทมเพลต cDNA คุณภาพสูงสำหรับการทดลอง RT-qPCR ของคุณและเคล็ดลับยอดนิยมสำหรับวิธีการดังกล่าว

ค้นพบโซลูชั่นที่ใช่สำหรับคุณ

ขั้นตอนการทำงานของจีโนมของคุณเริ่มต้นด้วยการทำให้กรดนิวคลีอิกบริสุทธิ์ เริ่มต้นอย่างมั่นใจและเพิ่มประสิทธิภาพเวิร์กโฟลว์ของคุณด้วยโซลูชันแบบแมนนวลและแบบอัตโนมัติของ Roche ใช้ตารางที่มีประโยชน์ของเราเพื่อเป็นแนวทางในการสกัดกรดนิวคลีอิกครั้งต่อไปของคุณ

PCR แบบเรียลไทม์ประสิทธิภาพสูง

รับประโยชน์จากประสบการณ์ของ Roche ในด้าน PCR แบบเรียลไทม์และได้ผลลัพธ์ที่แม่นยำและสม่ำเสมอด้วยเครื่องมือ น้ำยา การทดสอบ และอุปกรณ์แบบใช้แล้วทิ้งที่ครบครัน เพื่อให้เหมาะสมกับปริมาณงานหรืองบประมาณในห้องปฏิบัติการ


ผู้ช่วยออนไลน์นี้จะช่วยคุณค้นหาว่าการทำให้กรดนิวคลีอิกบริสุทธิ์และรีเอเจนต์ PCR แบบเรียลไทม์ใดที่เหมาะกับการใช้งานของคุณ


ข้อมูลที่คุณต้องการ เมื่อคุณต้องการ ตอนนี้ได้รับการปรับปรุงด้วยฟีดข่าวเพื่อให้ทันกับแนวโน้มปัจจุบันในการวิจัยและให้บริการใน 3 ภาษา: อังกฤษ จีน และญี่ปุ่น

ฐานข้อมูลสิ่งพิมพ์เวิร์กโฟลว์จีโนม

การรวบรวมสิ่งพิมพ์เกี่ยวกับผลิตภัณฑ์ Roche Genomic เฉพาะสำหรับการใช้งานวิจัยของคุณ

ปรับปรุงล่าสุดเมื่อ 20.04.2021
© 2021 Roche Molecular Systems, Inc.

ผลิตภัณฑ์มีไว้สำหรับการวิจัยด้านชีววิทยาศาสตร์เท่านั้น ไม่ใช้สำหรับขั้นตอนการวินิจฉัยเว้นแต่จะระบุไว้เป็นอย่างอื่น เว็บไซต์นี้มีข้อมูลเกี่ยวกับผลิตภัณฑ์ที่กำหนดเป้าหมายไปยังผู้ชมที่หลากหลาย และอาจมีรายละเอียดหรือข้อมูลผลิตภัณฑ์ไม่สามารถเข้าถึงได้หรือถูกต้องในประเทศของคุณ โปรดทราบว่าเราไม่มีส่วนรับผิดชอบใด ๆ ในการเข้าถึงข้อมูลดังกล่าวซึ่งอาจไม่สอดคล้องกับกระบวนการทางกฎหมาย ข้อบังคับ การลงทะเบียน หรือการใช้งานที่ถูกต้องในประเทศต้นทางของคุณ


แผ่น PCR-96 หลุมแผ่น

โปรดเลือกตัวเลือกของคุณเมื่อทำการสั่งซื้อ ถามเราหากคุณต้องการความช่วยเหลือ

ผลิตภัณฑ์นี้ไม่ได้อยู่ในสต็อก

ข้อมูลเพิ่มเติม

ผลิตในคลีนรูมที่ผ่านการรับรอง ISO9000 ของเรา ปราศจาก DNase/RNase หม้อนึ่งฆ่าเชื้อที่ 121 ℃ และแช่แข็งที่อุณหภูมิ -80 ℃

กรุณาเลือกหนึ่งในผลิตภัณฑ์ด้านล่างและระบุตัวเลือกของคุณในการสั่งซื้อ:

จานขาวหรือจานใส?

โปรไฟล์มาตรฐานกับโปรไฟล์ต่ำ?

จานรองกับจานรอง?

สินค้าแนะนำ

ดูคู่มือการเลือกเพลต PCR ของเราด้านล่าง หรือถามเราว่าคุณต้องการความช่วยเหลือหรือไม่

คู่มือการเลือก: 96-WELL PCR PLATES

ขาว VS. ชัดเจน:

แผ่นเพลตและท่อสีขาวส่งสัญญาณกลับไปยังเครื่องตรวจจับของเครื่องมือ qPCR มากกว่าแผ่นใสแบบเดิมอย่างมีนัยสำคัญ การสะท้อนของสัญญาณที่ได้รับการปรับปรุงช่วยให้แน่ใจว่าสามารถตรวจจับระดับการเรืองแสงที่ต่ำที่สุดได้ ผนังหลุมสีขาวยังหยุดสัญญาณไม่ให้ผ่านไปยังบล็อกของนักปั่น ซึ่งมันสามารถสะท้อนหรือดูดซับอย่างไม่สอดคล้องกัน นำไปสู่ระดับเสียงรบกวนที่เพิ่มขึ้นในการเรืองแสงที่ตรวจพบ สิ่งนี้จะป้องกันไม่ให้รูปแบบต่างๆ ในบล็อกนักปั่นไม่ส่งผลต่อข้อมูล qPCR พลาสติก PCR สีขาวของเราเพิ่มความไว ลดความแปรปรวน และเพิ่มอัตราส่วนสัญญาณต่อสัญญาณรบกวนภายในการทดสอบ qPCR

แผ่นใสให้ความสบายใจในการตรวจสอบขั้นตอนการปิเปตทันทีหลังจากการปิเปตแต่ละครั้ง เนื่องจากคุณจะเห็นรีเอเจนต์ที่เติมลงในบ่อน้ำตามที่คุณต้องการ แผ่นใสเหมาะสำหรับการใช้งานส่วนใหญ่

ข้อควรพิจารณาเหล่านี้ใช้กับหลุม 8 แถบและหลอด PCR แต่ละหลอดด้วย

โปรไฟล์มาตรฐานกับโปรไฟล์ต่ำ

หลุมโปรไฟล์มาตรฐาน (ความสูงเต็มประมาณ 21.0 มม.) เป็นหลุม "มาตรฐาน" เมื่อเทียบกับเพลตโปรไฟล์ต่ำ และพอดีกับวงจรความร้อนแบบคลาสสิกส่วนใหญ่และระบบตรวจจับ PCR แบบเรียลไทม์ เช่น iCycler® ของ Bio-Rad, iQ™ ซีรีส์จริง - ระบบตรวจจับ PCR ตามเวลา และระบบ PCR ปกติของ Applied Biosystems และซีเควนเซอร์ดีเอ็นเอ เพลตเหล่านี้ช่วยให้คุณใช้ปริมาณปฏิกิริยามาก เพลตเหล่านี้ลดความเสี่ยงจากการกระเด็นที่เกิดจากการปนเปื้อนข้าม ลดความเสี่ยงของการปนเปื้อนข้ามจากหลุมสู่บ่อ

หลุมโปรไฟล์ต่ำ (ประมาณ 15.5 มม.) เป็นการออกแบบใหม่ที่ลดศักยภาพในการเกิดคอนเดนเสท และมีข้อดีสำหรับการดักจับแสงในการทดสอบการเรืองแสง ปฏิกิริยาปริมาณต่ำ และ PCR ที่รวดเร็ว พวกเขาได้รับการแนะนำสำหรับเครื่องมือที่ใหม่กว่า เช่น C1000 Touch™ และ S1000™ Thermal Cyclers ของ Bio-Rad, ระบบตรวจจับ PCR แบบเรียลไทม์ของ CFX ซีรีส์ และระบบ PCR ที่รวดเร็วของ Applied Biosystems เพลทที่มีรายละเอียดต่ำช่วยลดพื้นที่ที่ตายแล้วและเพิ่มประสิทธิภาพ PCR

โปรดศึกษาคู่มือของระบบ PCR หากจำเป็นหรือสอบถามเรา เครื่องมือที่มีฝาปิดแบบปรับได้มักจะใช้ทั้งหลุมแบบมาตรฐานและแบบต่ำ เครื่องมือเหล่านี้รวมถึงวงจรความร้อนซีรีส์ 1000 และ DNA Engine® ของ Bio-Rad บางระบบต้องการโปรไฟล์มาตรฐานหรือแผ่นโปรไฟล์ต่ำเท่านั้น

ข้อควรพิจารณาเหล่านี้ใช้กับหลุม 8 แถบและหลอด PCR แต่ละหลอดด้วย

กึ่งกระโปรงกับไม่มีกระโปรง

เพลทกึ่งสเกิร์ตมีความทนทานต่อการบิดงอมากกว่าเนื่องจากความแข็งแกร่งที่เกิดจากสเกิร์ตที่ขอบด้านนอกของเพลท แผ่นเหล่านี้ยังอนุญาตให้ติดฉลากหรือบาร์โค้ด

รูปแบบที่ไม่หุ้มฉนวนเข้ากันได้กับนักปั่นความร้อนส่วนใหญ่ เพลตเหล่านี้ยังสามารถตัดเป็นขนาดหน้าตัดตามที่ผู้ใช้ต้องการ เพื่อไม่ให้เพลตทั้งหมดสูญเปล่า เมื่อต้องใช้น้อยกว่า 96 หลุมสำหรับการทดลองบางอย่าง


โปรโตคอล PCR มาตรฐาน

กันชน: ใช้ส่วนผสม 10x rxn ที่เป็นกรรมสิทธิ์หรือทำเองที่บ้าน เช่น Cetus, Promega สิ่งนี้ควรประกอบด้วย: ขั้นต่ำ 1.5mM Mg2+ โดยปกติจะมีผงซักฟอก อาจมีเจลาตินหรือ BSA ตอนนี้ Promega จัดหา MgCl2 ขนาด 25mM เพื่อให้ผู้ใช้ระบุ [Mg2+] สำหรับการเพิ่มประสิทธิภาพปฏิกิริยาด้วยไพรเมอร์และเป้าหมายที่แตกต่างกัน

ทำให้มาสเตอร์ผสมของรีเอเจนต์ที่ไม่มี DNA ใช้ปิเปตที่ปราศจาก DNA จากนั้นจ่ายไปยังหลอดแต่ละหลอด (โดยใช้ปิเปตที่ปราศจาก DNA) และเพิ่ม DNA ลงในปฏิกิริยาแต่ละอัน การใช้เคล็ดลับแบบเสียบปลั๊ก

ปฏิกิริยาซ้อนทับกับพาราฟินเหลวคุณภาพสูงหรือน้ำมันแร่ 50UL เพื่อให้แน่ใจว่าไม่มีการระเหยเกิดขึ้น: สิ่งนี้จะเปลี่ยนความเข้มข้นของสารตั้งต้น บันทึก: ภูมิปัญญาล่าสุดมีไว้ใช้ วาสลีน - สิ่งนี้ยังช่วยให้ "HOT สตาร์ท" PCR.

ใช้เคล็ดลับปิเปตแบบเสียบปลั๊ก: ป้องกันการปนเปื้อนของละอองลอยของปิเปต

แนะนำให้ใช้ผงซักฟอกสำหรับ Taq จาก Promega เท่านั้น (สูงสุด 0.1% v/v, Triton X-100 หรือ Tween-20) DMSO เห็นได้ชัดว่าช่วยให้มีการเปลี่ยนสภาพที่ดีขึ้นของลำดับเป้าหมายที่ยาวขึ้น (>1kb) และผลิตภัณฑ์มากขึ้น

ห้ามใช้ปิเปตเดียวกันในการจ่ายกรดนิวคลีอิกตามที่คุณใช้สำหรับการจ่ายรีเอเจนต์

โปรดจำไว้ว่าปริมาตรของตัวอย่างไม่ควรเกินปริมาตรปฏิกิริยาที่ 1/10 และความเข้มข้นของ DNA/NTP/ไพรเมอร์ของตัวอย่างไม่ควรสูงเกินไป มิฉะนั้น Mg2+ ที่มีอยู่ทั้งหมดจะถูกคีเลตออกจากสารละลายและปฏิกิริยาของเอนไซม์จะได้รับผลกระทบในทางลบ การเพิ่ม dNTP ที่มากกว่า 200uM หมายความว่า [Mg2+] ควรได้รับการปรับให้เหมาะสมอีกครั้ง

หลีกเลี่ยงการใช้บัฟเฟอร์ที่มี EDTA เป็น EDTA CHELATES Mg 2 +

ควรเลือกใช้ไพรเมอร์ เป้าหมาย แทค และความเข้มข้นของนิวคลีโอไทด์ต่ำ เนื่องจากโดยทั่วไปแล้วจะทำให้มั่นใจได้ว่าผลิตภัณฑ์สะอาดกว่าและพื้นหลังที่ต่ำกว่า อาจทำให้ต้องเสียค่าความไวในการตรวจจับ

เงื่อนไขการเกิดปฏิกิริยาที่แนะนำ:

เงื่อนไขเบื้องต้น:

การทำให้เสียสภาพเบื้องต้นเมื่อเริ่มต้น: 92 - 97oC เป็นเวลา 3 - 5 นาที หากคุณเปลี่ยนสภาพที่อุณหภูมิ 97oC ตัวอย่างเดนเนเจอร์จะเพิ่มส่วนผสมที่เหลือหลังจากปฏิกิริยาคอลคอลกับอุณหภูมิการหลอมเท่านั้น

อุณหภูมิการหลอมเริ่มต้น: สูงสุดที่เป็นไปได้เป็นเวลา 3 นาที (เช่น: 50 - 75oC) เงื่อนไขเริ่มต้นที่เข้มงวดหมายถึงผลิตภัณฑ์ที่ไม่เฉพาะเจาะจงน้อยลง โดยเฉพาะอย่างยิ่งเมื่อขยายจาก DNA ของยูคาริโอต

อุณหภูมิการยืดตัวเริ่มต้น: 72oC เป็นเวลา 3 - 5 นาที ซึ่งช่วยให้ยืดผลิตภัณฑ์ได้อย่างสมบูรณ์บนเทมเพลตที่หายาก

การขี่จักรยานอุณหภูมิ:

  • 92 - 94 o C เป็นเวลา 30-60 วินาที (denature)
  • 37 - 72 o C เป็นเวลา 30 - 60 วินาที (อบอ่อน)
  • 72 o C เป็นเวลา 30 - 60 วินาที (ยืดออก) (60 วินาทีต่อความยาวลำดับเป้าหมาย kb)
  • 25 - 35 รอบเท่านั้น (มิฉะนั้นการสลายตัวของเอนไซม์ทำให้เกิดสิ่งประดิษฐ์)
  • 72 o C เป็นเวลา 5 นาทีที่ปลายเพื่อให้ DNA ผลิตภัณฑ์ทั้งหมดยืดออกได้อย่างสมบูรณ์

"Quickie" PCR ค่อนข้างเป็นไปได้: เช่น [94 o C 30 วินาที / 45 o C 30 วินาที / 72 o C 30 วินาที] x 30 สำหรับผลิตภัณฑ์แบบสั้น (200 - 500 bp)

คุณสามารถใช้กลีเซอรอลในรูปฏิกิริยาของวงจรความร้อนเพื่อให้แน่ใจว่ามีการสัมผัสทางความร้อนที่ดี

อย่าวิ่งหลายรอบเกินไป: ถ้าคุณไม่เห็นแถบที่มี 30 รอบ คุณอาจจะไม่เห็นหลังจาก 40 รอบ แทนที่จะใช้ส่วนลงตัวจากส่วนผสมของปฏิกิริยาและ PCR ใหม่ด้วยรีเอเจนต์ใหม่ ดู ที่นี่.

"เริ่มร้อน" PCR:

ในบางกรณีบุคคลปรารถนาที่จะ หลีกเลี่ยงการผสมไพรเมอร์และ DNA เป้าหมายที่อุณหภูมิต่ำต่อหน้าTaq พอลิเมอเรส: Taq pol เกือบจะมีประสิทธิภาพเท่ากับ Klenow pol ที่37 o ดังนั้น ถ้าไพรเมอร์หลอมผิดที่อุณหภูมิต่ำก่อนการเสียสภาพของเทมเพลตเริ่มต้น "non-specific" อาจมีการขยายสัญญาณ. สิ่งนี้สามารถหลีกเลี่ยงได้โดยการเพิ่มเอ็นไซม์หลังจากการทำให้เสียสภาพเบื้องต้นเท่านั้น ก่อนที่ปฏิกิริยาจะเย็นลงจนถึงอุณหภูมิการหลอมที่เลือก สะดวกที่สุดโดยการใส่แว็กซ์ "gems" TM ลงในหลอดปฏิกิริยาหลังจากเติมทุกอย่างยกเว้นเอ็นไซม์แล้ววางเอ็นไซม์บนอัญมณี: ขี้ผึ้งจะละลายเมื่ออุณหภูมิถึง +/-80 o C และเอ็นไซม์ผสมกับส่วนผสมของปฏิกิริยาที่เหลือในขณะที่ขี้ผึ้งหลอมเหลวลอย ด้านบนและผนึกส่วนผสมแทนที่น้ำมันแร่ ข้อมูลคือว่า "gems" อาจใช้ Vaseline TM แทนได้

PCR แบบอสมมาตรสำหรับการผลิต ssDNA:

เพียงใช้อัตราส่วนโมลาร์ 100:1 ของไพรเมอร์สองตัว (เช่น: ไพรเมอร์ 1 ที่ 0.5uM, ไพรเมอร์ 2 ที่ 0.005uM) ซึ่งช่วยให้สามารถผลิต ssDNA เป็นหลักสำหรับความรู้สึกของไพรเมอร์ที่มีปริมาณมากขึ้น ซึ่งมีประโยชน์สำหรับการเรียงลำดับหรือการสร้างโพรบ ssDNA

การตรวจจับผลิตภัณฑ์:

ใช้ 1/10 - 1/3 ของส่วนผสมปฏิกิริยา อย่างระมัดระวัง จากใต้น้ำมันหรือจากใต้วาสลีนหรือแว็กซ์ที่แข็งตัวโดยใช้ไมโครปิเปตที่มีปลายเสียบ ในพื้นที่ที่ห่างจากพื้นที่เตรียม PCR ของคุณ!

ผสมสิ่งนี้กับบัฟเฟอร์โหลดบัฟเฟอร์ (1:1 - 1:5 ผสม:บัฟเฟอร์การโหลด): นี่คือ TBE ที่มีกลีเซอรอลหรือซูโครส 10 - 20% และสีย้อมติดตามโบรโมฟีนอลบลู (BPB)

บรรจุตัวอย่าง 5 - 30ul ลงในหลุม 0.8 - 3.0% เจลอากาโรสใต้น้ำที่สร้างขึ้นใน TBE ควรมีเอทิเดียมโบรไมด์ 50ng/มล.

ทำงานที่ 80 -120 โวลต์ (ไม่ช้าเกินไปหรือผลิตภัณฑ์ขนาดเล็กกระจายไม่เร็วเกินไปหรือเป็นแถบเปื้อน) จนกว่า BPB จะถึงจุดสิ้นสุดของเจล (ผลิตภัณฑ์ขนาดใหญ่) หรือเจลดาวน์ 2/3 (ผลิตภัณฑ์ขนาดเล็ก) ใช้เครื่องหมาย DNA จาก 2kb เหลือ 100 bp หรือน้อยกว่า (แนะนำ BM PCR markers)

ดูบนกล่องไฟยูวีที่ 254 - 300 นาโนเมตร ภาพที่ 1 - 5 วินาที

ผลิตภัณฑ์ขนาดเล็กมองเห็นได้ดีที่สุดบนเจล agarose 3% ที่ได้รับ วิ่งเร็ว (เช่น 100 โวลต์) โดย BPB จะวิ่งไปที่ ½ - 2/3 ตามเจล เป็นการดีที่สุดที่จะรวม EthBr ไว้ในเจลและในเจลบัฟเฟอร์ เนื่องจากการย้อมหลังอิเล็กโทรโฟเรซิสอาจส่งผลให้เกิดการเลอะแถบเนื่องจากการแพร่ และหากไม่มี EthBr ในบัฟเฟอร์ สีย้อมจะไหลย้อนกลับออกจากเจล และแถบที่เล็กกว่าจะถูกลอกด้วยสีย้อมและไม่สามารถมองเห็นได้

เจล NUSIEVE TM (FMC Corp) สามารถใช้กับผลิตภัณฑ์ขนาดเล็กได้ - ความละเอียดดีกว่า agarose

โพลีอะคริลาไมด์ เจลสามารถย้อมสีเงินได้ด้วยโปรโตคอลง่ายๆ สำหรับความไวในการตรวจจับที่รุนแรง

เจลซับได้ โดยตรงหลังจากแช่ใน NaOH 0.5M / 1.5M NaCl เป็นเวลา 10-20 นาที: "dry blotting" ทำงานได้ดี (เช่น: เจลทาทับและซ้อนใต้ชั้นด้วยกระดาษเช็ดมือและแถบกดเลื่อนขึ้นและลง) เช่นเดียวกับการซับ "Southern" แบบคลาสสิก . แถบที่มีรอยซับด้วยวิธีนี้จะยึดติดด้วยโควาเลนต์บนเยื่อไนลอนอยู่แล้ว และเพียงแค่ต้องล้างด้วย 5xSSPE ก่อนไฮบริไดเซชัน

ตัวอย่างที่แสดงคือการตรวจจับของ ฮิวแมนแพพพิลโลมาไวรัส ดีเอ็นเอชนิดที่ 16 (HPV-16) ขยายจากตัวอย่างชิ้นเนื้อปากมดลูก ( Williamson AL, Rybicki EP (1991) การตรวจหา papillomaviruses ที่อวัยวะเพศของมนุษย์โดยการขยายปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรสด้วยไพรเมอร์ที่ซ้อนกันที่เสื่อมสภาพ J Med Virol 33: 165-171) แผงด้านซ้ายเป็นภาพถ่ายของเจล agarose 2% ที่ย้อมด้วย EthBR ด้านขวาเป็นภาพรังสีอัตโนมัติของ Southern blot ที่ตรวจสอบด้วย DNA HPV-16 ที่ติดฉลาก 32 P สังเกตว่าการซับที่ละเอียดอ่อนนั้นมีความสำคัญเพียงใด และการตรวจจับนั้นเจาะจงมากเพียงใด

การติดฉลากผลิตภัณฑ์ PCR ด้วย Digoxigenin

ผลิตภัณฑ์ PCR อาจติดฉลากอย่างสะดวกด้วย digoxigenin-11-dUTP (Boehringer-Mannheim) โดยการรวมรีเอเจนต์เข้ากับความเข้มข้น dTTP ที่มีประสิทธิผลขั้นสุดท้าย 10-35% ในส่วนผสมของนิวคลีโอไทด์ของความเข้มข้นสุดท้าย 50-100uM dNTPs (Emanual, 1991 กรดนิวคลีอิก Res 19 : 2790). วิธีนี้ช่วยให้สามารถทดแทนโพรบตามความยาวที่กำหนดไว้ได้ในระดับที่ทราบ ซึ่งจะทำให้เงื่อนไขโดยบริไดเซชันที่กำหนดได้อย่างแม่นยำ นอกจากนี้ยังเป็นวิธีที่มีประสิทธิภาพมากที่สุดในการติดฉลากผลิตภัณฑ์ PCR เนื่องจากอาจไม่ปลอดภัยและมีราคาแพงมากในการพยายามทำเช่นเดียวกันกับ 32P-dNTP และการรวมป้ายกำกับแบบ Nick-translation หรือ Random Primed label นั้นไม่เหมาะสมเนื่องจากเทมเพลตมักมีขนาดเล็กเกินไปสำหรับประสิทธิภาพ การติดฉลาก

สร้างมิกซ์ DIG-dNTP สำหรับ PCR ดังนี้:

ความเข้มข้นของสารผสม DIG NUCLEOTIDE

  • Dig-11-dUTP 350 uM
  • dTTP 650 uM
  • dATP 1 mM
  • dCTP 1 mM
  • dGTP 1 mM

สำหรับแต่ละโพรบที่สังเคราะห์ได้ 50 ไมโครลิตร การเจือจาง 1/10 ถูกสร้างขึ้นจากของผสม DIG-นิวคลีโอไทด์เมื่อถูกเติมไปยังรีเอเจนต์อื่นตามที่บรรยายไว้ข้างต้น ผลิตภัณฑ์อาจวิเคราะห์โดย agarose gel electrophoresis - หมายเหตุ: ผลิตภัณฑ์มีขนาดใหญ่กว่าผลิตภัณฑ์ที่ไม่ได้ทดแทน - และตรวจพบโดยตรงบนรอยเปื้อนทางภูมิคุ้มกัน โพรบสามารถใช้เป็นส่วนลิคอต 5-10 ul ได้โดยตรงจากส่วนผสมของผลิตภัณฑ์ PCR ผสมกับส่วนผสมแบบไฮบริไดเซชันและแปลงสภาพ โพรบสามารถนำกลับมาใช้ใหม่ได้มากถึง 10 ครั้ง เก็บไว้ในช่องแช่แข็งระหว่างการทดลอง และต้มเพื่อทำให้เสียสภาพ

ทำความสะอาดผลิตภัณฑ์ PCR

  • การกำจัดน้ำมันแร่: เพียงเติมคลอโรฟอร์ม 50ul ลงในขวดปฏิกิริยา กระแสน้ำวน และเครื่องหมุนเหวี่ยงชั่วครู่ และนำ "hanging droplet" ของ น้ำ สารละลายด้วยไมโครปิเปต
  • การกำจัดแว็กซ์หรือวาสลีน: เพียง "spear" แว็กซ์อัญมณีแล้วเอาออก เช่นเดียวกับน้ำมันหรือหลอดเจาะก้น และเป่าน้ำยาวาสลีนออก
  • ทำความสะอาด DNA: 3 ตัวเลือก
    • โปรโตคอลที่ให้ DNA ที่สะอาดเพียงพอสำหรับการจัดลำดับมีดังต่อไปนี้: เพิ่มปริมาตรเป็น 100ul ด้วยน้ำ, เพิ่ม 10M ammonium acetate soln ความเข้มข้นสุดท้าย 0.2M (ปริมาตรที่ 1/5) เติมไอโซโพรพานอลในปริมาณเท่ากัน (โพรแพน-2-ออล) ทิ้งไว้บนม้านั่ง 5 นาที ปั่นแยก 20 นาทีที่ 15,000 รอบต่อนาที ขจัดของเหลวโดยใช้ปิเปต แขวนลอยใหม่ในน้ำ 100ul หรือ TE ซ้ำฝน.
    • เพียงแค่ทำการสกัดฟีนอล-CHCl3 (เพิ่มฟีนอล 20ul ให้กับเฟสน้ำ, น้ำวน, เพิ่ม 50ul CHCl3, น้ำวน, เครื่องหมุนเหวี่ยง, ลบ บน เฟสที่เป็นน้ำ, ทำการสกัด CHCl3 ซ้ำ)
    • สร้างเฟสที่เป็นน้ำได้ถึง 400ul และหมุนผ่านตลับหมึก Millipore Ultrafree-MC NMWL 30 000 (ที่ 6,000 รอบต่อนาทีในไมโครเซนตริฟิวจ์) ล้างด้วยน้ำ 2x400ul เก็บตัวอย่าง +/-20ul: ซึ่งเพียงพอสำหรับการจัดลำดับ

    ผลิตภัณฑ์สะอาดเพียงพอสำหรับการย่อยแบบจำกัดทันทีหลังจากเกิดปฏิกิริยา อย่างไรก็ตาม แนะนำให้ทำความสะอาดฟีนอล-คลอโรฟอร์มเป็นอย่างน้อย

    การจัดลำดับผลิตภัณฑ์ PCR:

    วิธีนี้ทำได้ดีที่สุดโดยใช้ ssDNA ที่สร้างโดย PCR แบบอสมมาตร และไพรเมอร์ "limating" สำหรับการจัดลำดับ อย่างไรก็ตาม การจัดลำดับ dsDNA อย่างมีประสิทธิภาพที่สร้างโดย PCR ปกตินั้นสามารถทำได้โดยใช้การปรับเปลี่ยนโปรโตคอล SequenaseTM ที่เผยแพร่โดย Bachmann et al. (1990) (NAR 18: 1309). ดีเอ็นเอสะอาด ถูกแขวนลอยใหม่ในบัฟเฟอร์สำหรับการจัดลำดับที่มี 0.5% Nonidet P-40 และ 0.5% Tween-20 และไพรเมอร์สำหรับการจัดลำดับ ถูกทำให้เสียสภาพโดยการให้ความร้อนถึง 95oC เป็นเวลา 5 นาที ระบายความร้อนด้วยน้ำแข็งเปียก และจัดลำดับโดยโปรโตคอล "close-to-primer" (เช่น : สารต่อขยายแบบเจือจาง)

    การโคลนผลิตภัณฑ์ PCR

    กลยุทธ์การโคลน TA: Taq และพอลิเมอเรสอื่นๆ ดูเหมือนจะมีกิจกรรมเทอร์มินอลทรานส์เฟอเรสซึ่งส่งผลให้เกิดการเติมนิวคลีโอไทด์เดี่ยวแบบไม่มีเทมเพลทไปยังปลาย 3' ของผลิตภัณฑ์ PCR เมื่อมี dNTP ทั้งหมด 4 ตัว dA จะถูกเติมอย่างพิเศษ อย่างไรก็ตาม การใช้ dNTP เดี่ยวในส่วนผสมของปฏิกิริยาส่งผลให้เกิดการเติม (ค่อนข้างไม่มีประสิทธิภาพ) ของนิวคลีโอไทด์นั้น สิ่งนี้ทำให้เกิดความยุ่งยากในการโคลน เนื่องจากผลิตภัณฑ์ PCR ปลายทู่ที่คาดคะเนมักจะไม่ได้ผล และโปรโตคอลการโคลนแบบปลายทู่มักจะไม่ทำงานหรือไม่มีประสิทธิภาพมาก ซึ่งสามารถแก้ไขได้โดยการบ่มผลิตภัณฑ์ PCR ที่มี T4 DNA pol หรือ Klenow pol ซึ่ง "polishes" สิ้นสุดเนื่องจากกิจกรรม exonuclease 3'->5' (Lui and Schwartz, 1992 BioTechniques, 20: 28-30) อย่างไรก็ตาม กิจกรรมการถ่ายโอนเทอร์มินัลนี้ยังเป็นพื้นฐานของกลยุทธ์การโคลนที่ชาญฉลาดด้วย: สิ่งนี้ใช้ Taq pol เพื่อเพิ่ม dT เดียวไปยัง 3'-ends ของเวกเตอร์การโคลนแบบตัดทู่ เช่น pUC หรือ pBluescriptTM และการเชื่อมโยงอย่างง่ายของ ผลิตภัณฑ์ PCR เป็นพลาสมิด "sticky-ended" ในขณะนี้ (Marchuk et al., 1990 NAR 19: 1156)

    การรวมตัวกันของไซต์ข้อจำกัดใน Primers: แม้ว่าสิ่งนี้อาจจะทำให้ง่ายโดยการรวมไซต์การจำกัดที่เหมือนกันหรือต่างกันที่ปลาย 5' ของไพรเมอร์ PCR - ซึ่งช่วยให้สร้างปลายเหนียวและการโคลนที่ตรงไปตรงมาในเวกเตอร์ที่เหมาะสม - สิ่งเหล่านี้ควรมี อย่างน้อย ฐานเพิ่มเติมสองฐาน 5' ไปยังลำดับการรู้จำ เพื่อให้แน่ใจว่าเอ็นไซม์จะรับรู้ลำดับนั้นจริงๆ - และมักพบว่าแม้เมื่อทำเช่นนี้แล้ว ประสิทธิภาพของการตัดผลิตภัณฑ์สดก็ยังเป็นศูนย์ ซึ่งบางครั้งสามารถแก้ไขได้ด้วยการบ่มผลิตภัณฑ์สดที่มีโปรตีนเค (เพื่อย่อย Taq pol ที่ติดแน่น) แต่มักไม่เป็นเช่นนั้น วิธีแก้ปัญหาคือใช้วิธี "Klenow-Kinase-Ligase" (KKL) ซึ่งเกี่ยวข้องกับผลิตภัณฑ์ "polishing" กับ Klenow โดยไคเนสเพื่อให้ได้ 5'-phosphorylation (หมายเหตุ: ไพรเมอร์ OLIGONUCLEOTIDE ปกติไม่มี 5'-ฟอสเฟต ) มัดชิ้นส่วนเข้าด้วยกันเพื่อให้ได้คอนคาเมอร์ จากนั้นจำกัดสิ่งเหล่านี้ด้วยเอ็นไซม์จำกัดที่เหมาะสมเพื่อสร้างชิ้นส่วนปลายเหนียวที่เหมาะสำหรับการโคลนนิ่ง (Lorens, 1991 PCR Methods and Applications, 1: 140-141)


    แผ่น แถบ และซีลสำหรับ PCR, PCR แบบเรียลไทม์และการจัดลำดับ 24 หน้า

    วัสดุสิ้นเปลือง EuroClone PCR ผลิตขึ้นสำหรับนักปั่นความร้อน ระบบ PCR แบบเรียลไทม์ และซีเควนเซอร์เพื่อประสิทธิภาพการปั่นที่ดีที่สุด การผลิตและการควบคุมคุณภาพ วัสดุสิ้นเปลืองพลาสติกทั้งหมดผลิตขึ้นภายใต้สภาวะห้องปลอดเชื้อในโรงงานฉีดขึ้นรูปที่ทันสมัย อนุภาค เซลล์แบคทีเรีย และสารปนเปื้อนอื่นๆ ถูกกรองจากบรรยากาศ ผลิตภัณฑ์ได้รับการตรวจสอบ QC ที่หลากหลายทั้งในระหว่างและหลังกระบวนการผลิต การทดสอบด้วยภาพและทางชีววิทยาช่วยให้มั่นใจได้ว่าไม่มีสิ่งปนเปื้อนและความสมบูรณ์ของ PCR เชิงปริมาณ โดยเฉพาะการขาด

    เพลต FrameStar® แผ่น Primo FrameStar® 2 ส่วนประกอบเพลท Primo FrameStar® PCR ช่วยเพิ่มเสถียรภาพทางความร้อนที่อุณหภูมิสูง ป้องกันการสูญเสียตัวอย่างโดยลดการขยายตัวทางความร้อนระหว่าง PCR การออกแบบสององค์ประกอบผสมผสานข้อดีของท่อโพลีโพรพิลีนผนังบางเพื่อให้ได้ผลลัพธ์ PCR ที่ดีที่สุด และกระโปรงและพื้นโพลีคาร์บอเนตที่แข็งเพื่อความเสถียรทางความร้อนและความแข็งแกร่งสูงสุด ตรงกันข้ามกับเพลท PCR แบบชิ้นเดียวแบบมาตรฐาน การระเหยจากตำแหน่งมุมและแถวด้านนอกนั้นน้อยมาก ทำให้สามารถลดขนาดของปริมาณรีเอเจนต์และประหยัดต้นทุนได้ &bull เทคโนโลยีสององค์ประกอบลดลง

    เพลต FrameStar® Primo® Framestar® 384 Well ออกแบบมาสำหรับ PCR ที่มีอัตราข้อมูลสูง FrameStar® 384 เข้ากันได้กับ 384 block PCR, qPCR และเครื่องมือจัดลำดับส่วนใหญ่ การออกแบบสององค์ประกอบที่แข็งแกร่งช่วยลดการบิดเบี้ยวและการบิดเบือนระหว่าง PCR ทำให้เหมาะสำหรับใช้กับระบบหุ่นยนต์ แมว. Primo® Framestar® 384 หลุมเพลทเคลียร์เพลท เหมาะอย่างยิ่งสำหรับใช้กับระบบหุ่นยนต์ การอ้างอิงตารางตัวอักษรและตัวเลข เข้ากันได้กับ 384 block PCR ส่วนใหญ่ qPCR 30 µl ความจุในการทำงานที่แนะนำ (ความจุสูงสุด 55 µl) ความกว้างเพลท: ความลึกของเพลท: ระยะห่างถึงศูนย์กลางของ A1 จากขอบด้านบน : ระยะทางถึง.

    เพลท FrameStar® Primo® Framestar® 96 กึ่งสเกิร์ต โปรไฟล์มาตรฐาน (มุมตัด A12) ออกแบบมาโดยเฉพาะเพื่อให้เข้ากันได้โดยตรงกับวงจรระบายความร้อนหลัก ๆ ทั้งหมด รวมถึงเครื่องมือ ABi ทั้งหมด เพลตนี้สามารถใช้ได้โดยตรงในเครื่องมือ ABi 96well โดยไม่ต้องใช้อะแดปเตอร์ การออกแบบสององค์ประกอบที่แข็งแกร่งช่วยลดการบิดเบี้ยวและการบิดเบือนระหว่าง PCR ทำให้เหมาะสำหรับใช้กับระบบหุ่นยนต์ กึ่งกระโปรงช่วยให้ติดฉลากหรือบาร์โค้ดได้ เพลทรุ่นนี้ยังมีแบบมีขาตั้ง (ECPCR0730C) ด้วย แมว. Primo® Framestar® 96 หลุม เพลทกึ่งสเกิร์ต หลุมใส Primo® Framestar® 96.

    เพลตมาตรฐาน เพลตมาตรฐาน ท่อผนังบางของเพลต PCR มาตรฐาน EuroClone ถ่ายเทความร้อนได้สูงสุด และขอบยกสูงช่วยให้ปิดผนึก กลุ่มผลิตภัณฑ์ประกอบด้วยแบบไม่มีขอบ แผ่นกึ่งกระโปรง 2 แผ่น และแบบมีกระโปรงเต็มแผ่น เพลตแบบไม่มีสเกิร์ตยังมีให้บริการในรูปแบบเพลต Tear-A-Way PCR ซึ่งเป็นเพลตสองประเภทที่มีรูพรุนทั้งในแนวตั้ง ฉีกเป็นแถบ 8 หลุม หรือในแนวนอน ฉีกเป็นแถบ 12 หลุม Primo® 96 หลุม เพลท, ไม่มีสเกิร์ต เข้ากันได้กับวงจรระบายความร้อนและซีเควนเซอร์ส่วนใหญ่ หลุมที่ชัดเจน การอ้างอิงตารางสีดำสำหรับตัวอย่างง่าย

    เพลทมาตรฐาน Primo® 96 หลุม เพลท, กึ่งสเกิร์ต เข้ากันได้กับวงจรระบายความร้อนและซีเควนเซอร์ส่วนใหญ่ หลุมที่ชัดเจน การอ้างอิงตารางสีดำเพื่อการระบุตัวอย่างได้ง่าย ขอบหลุมที่ยกขึ้นป้องกันการปนเปื้อนข้ามและอำนวยความสะดวกในการปิดผนึก เหมาะสำหรับการปิดผนึกฝา (ECPCR0751 และ ECPCR0752) ความร้อนและการปิดผนึกด้วยกาว 250 µl ความจุในการทำงานที่แนะนำ (ความจุสูงสุด 300 µl) ความกว้างเพลท: ความลึกของเพลท: จาน Primo 96 หลุม หลุมกึ่งสเกิร์ต หลุมใส ความกว้างของเพลท: ความลึกของเพลท: ระยะห่างถึงศูนย์กลางของ A1 จากขอบด้านบน: ระยะห่างถึงศูนย์กลางของ A1 จากขอบด้านซ้าย: ระยะห่าง (ระยะห่างระหว่าง A1 และ A2): อืม

    เพลทมาตรฐาน Primo® 96 หลุม เพลท, สเกิร์ต, โปรไฟล์ต่ำ เข้ากันได้กับวงจรระบายความร้อนและซีเควนเซอร์ส่วนใหญ่ หลุมล้าง โปรไฟล์ต่ำ การอ้างอิงกริดสีดำสำหรับการระบุตัวอย่างง่าย ขอบหลุมที่ยกขึ้นป้องกันการปนเปื้อนข้ามและอำนวยความสะดวกในการปิดผนึก เหมาะสำหรับการปิดผนึกฝา (ECPCR0751 และ ECPCR0752) ความร้อน และการปิดผนึกด้วยกาว 150 µl ความลึกในการทำงานที่แนะนำ: 85,48±0,50 mm ความจุเพลท (ความจุสูงสุด 200 µl) ความกว้างของเพลท: เส้นผ่านศูนย์กลางของหลุม (c): ระยะห่างจากขอบด้านบน A1 ถึงศูนย์กลางของ A1: จาน Primo 96 หลุม Skirted, Low Profile, เคลียร์ 50 14,38±0,25 mm Distance to center of A1 from left edge.

    PCR Tubes & Strips หลอด EuroClone และแถบฝาปิดผลิตจากโพลีโพรพิลีนบริสุทธิ์ในโรงงานผลิตคลีนรูมที่ได้รับการรับรองมาตรฐาน ISO Class 7 แถบมีให้ในรูปแบบมาตรฐานและยังมีท่อทรงเตี้ย Primo 0.2ml หลอด PCR แบบแยกส่วน ฝาปิดแบบแบน การออกแบบหมวกแบบแบนและแบบโดม Primo® 0.2ml หลอด PCR แบบแยกส่วน ฝาปิดแบบโดม เหมาะสำหรับทุกมาตรฐาน 0.2ml block thermal cyclers 0.25 มล. ความจุในการทำงานที่แนะนำ (ความจุสูงสุด 0.3 มล.) เหมาะสำหรับนักปั่นความร้อนมาตรฐานส่วนใหญ่ หลอดที่มีหมายเลข มีให้เลือกทั้งแบบมีฝาปิดแบบโดมหรือแบบแบน RNase, Dnase, จีโนมของมนุษย์

    แถบท่อโปรไฟล์ต่ำ Primo® แถบท่อ PCR โปรไฟล์ต่ำของ Primo มีจำหน่ายในโพรพิลีนใสสำหรับเทคนิค PCR มาตรฐาน สำหรับการตรวจจับด้วยหลอดฟลูออเรสเซนต์ เช่น แถบ PCR โปรไฟล์ต่ำ qPCR มีให้เลือกใช้กับหลอดหลุมสีขาวซึ่งให้ความไวสูงสุดและความสม่ำเสมอสูงสุด เนื่องจากแสงเรืองแสงส่วนใหญ่สะท้อนกลับไปยังเครื่องตรวจจับ แมว. รายละเอียดสินค้า Primo Low profile 8 หลอด/สตริป หลุมล้าง + ฝาปิดออปติคัลแบน Primo® โปรไฟล์ต่ำ 8 หลอด/แถบ White wells + flat optical caps Available with either clear or white tubes Supplied with flat optical caps RNase, Dnase, human.

    Adhesive Sealing Tapes Adhesive Sealing Tapes EuroClone offers a wide range of adhesive sealing materials processed under strictly controlled environmental conditions and certified free from DNase, RNase and human genomic DNA. Primo® PCR Seals A strong polyester transparent adhesive seal recommended for PCR but it can also be used for qPCR and other optical applications. This seal enables a high seal integrity and efficiently prevents sample evaporation. The seal can be easily peeled from the plate. The PCR seal is also available in a flexible format with perforated sheets to enable tearing.


    Parting Words

    While these tips may seem like common sense to qPCR experts, they should help newcomers to save a lot of time and money, and well as maximize their chances of getting consistent results! There are also many online support resources, including a very active Yahoo List group. Fortunately, there are many experts who enjoy helping others master the art of qPCR.

    If you want to share your best practices tips, get in touch with us by writing in the comments field!

    Literature:

    Originally published on January 20, 2009. Revised and updated in May 2017.


    ดูวิดีโอ: Real time PCR (สิงหาคม 2022).