ข้อมูล

ช่องโซเดียมยังคงต่ออายุตัวเองด้วยหน่วยย่อยใหม่ที่สร้างโดยยีนหรือไม่?

ช่องโซเดียมยังคงต่ออายุตัวเองด้วยหน่วยย่อยใหม่ที่สร้างโดยยีนหรือไม่?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

ยีนทำให้หน่วยย่อยอัลฟ่าบีตาแกมมา (โปรตีน) มาใช้ในการสร้างช่องโซเดียม… ถ้าเข้าใจถูกต้อง ? ดังนั้น เนื่องจากยีนยังคงสร้างหน่วยย่อยเหล่านั้น นั่นหมายความว่าช่องโซเดียมใหม่ถูกสร้างขึ้นอย่างต่อเนื่องด้วยโปรตีนเหล่านั้นจนกว่าคุณจะตายหรือไม่? กล่าวอีกนัยหนึ่ง ถ้าจู่ๆ ยีนเหล่านั้นหยุดสร้างยูนิตย่อยในวัย 50 ปีของคุณหรืออะไรสักอย่าง ช่องโซเดียมของคุณจะหายไปหรือหยุดทำงาน? (อาจไม่สมจริง แต่ในทางทฤษฎี… )


คุณกำลังถามเกี่ยวกับสองกระบวนการที่แตกต่างกัน: การหมุนเวียน (การย่อยสลาย) ของ mRNA และการหมุนเวียนของโปรตีน ในเซลล์ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมทั่วไป ครึ่งชีวิตของ mRNA ของข้อความที่เสถียรจะเข้าใกล้ความยาวของวัฏจักรเซลล์ (เช่น 24 ชั่วโมง) หนึ่ง mRNA สามารถแปลได้ตลอด 24 ชั่วโมงหากต้องการ โปรตีนที่ได้จะมีครึ่งชีวิตที่วัดได้ และจะแปรผันตามโปรตีนและสภาวะของเซลล์ ถ้าเซลล์ไม่มีโปรตีนและ mRNA ของมัน มักจะมีวงจรป้อนกลับที่กระตุ้นการถอดรหัสของยีนโครงสร้างกลับเข้าไปในนิวเคลียส


คุณควรศึกษาข้อมูลพื้นฐานก่อนถามข้อมูลเฉพาะเกี่ยวกับโปรตีนชนิดใดชนิดหนึ่ง ฉันไม่ได้ลงคะแนนเพื่อปิดคำถามอย่างไรก็ตาม

DNA เร่งการก่อตัว mRNA (การถอดความ) ซึ่งจะเร่งการก่อตัวของโพลีเปปไทด์ (การแปล); RNA polymerase และ ribosome เป็นตัวเร่งปฏิกิริยาร่วมตามลำดับ

โปรตีนที่ใช้งานได้อาจมีสายโซ่โพลีเปปไทด์จำนวนมากเช่นเดียวกับในกรณีของช่องโซเดียม (หรือแม้แต่ฮีโมโกลบิน) หน้าที่ของโปรตีนเชิงซ้อนอาจลดลงหาก:

  • ไม่เกิดสายโซ่โพลีเปปไทด์
  • สายโซ่โพลีเปปไทด์ไม่ได้เชื่อมโยงกันอย่างถูกต้อง

แบบแรกอาจส่งผลให้เกิดการบล็อกในการแปลหรือบล็อกในการถอดความ การบล็อกเหล่านี้อาจเกิดขึ้นได้เนื่องจากการควบคุมแบบแอคทีฟเพื่อตอบสนองต่อสภาวะบางอย่าง นี่เป็นการเปลี่ยนแปลงชั่วคราว

การกลายพันธุ์สามารถนำไปสู่การสูญเสียการทำงานโดยทำให้เกิดบล็อคการถอดรหัส/การแปลหรือยกเลิกอันตรกิริยาระหว่างโพลีเปปไทด์ที่ต่างกันอย่างใดอย่างหนึ่ง

ในเซลล์ สารชีวโมเลกุลทั้งหมดจะก่อตัวและเสื่อมสภาพอย่างต่อเนื่อง อัตราที่ลดลงเรียกว่าการหมุนเวียน หากต้องรักษาระดับให้คงที่ อัตราการหมุนเวียนก็ควรสมดุลด้วยอัตราการก่อตัว

เมื่อการก่อตัวถูกยกเลิก ชีวโมเลกุลต่างๆ จะหายไปด้วยความเร็วเป็นสัดส่วนกับอัตราการย่อยสลายของพวกมัน
หากการกลายพันธุ์ทำให้เกิดการสูญเสียการเชื่อมโยงของโพลีเปปไทด์ โปรตีนที่ไม่ทำงานจะแทนที่โปรตีนที่ทำหน้าที่ด้วยอัตราตามสัดส่วนกับอัตราการย่อยสลาย (หมายเหตุ: อัตราการก่อตัวของโปรตีนเป็นสัดส่วนกับ mRNA ที่มีอยู่)

โปรตีนภายในเซลล์และเมมเบรนส่วนใหญ่มีการหมุนเวียนสูง โปรตีนโครงสร้างภายนอกเซลล์เช่นคอลลาเจนมีการหมุนเวียนค่อนข้างต่ำ ดังนั้นหากยีนโซเดียมแชนเนลหยุดถ่ายทอดผลกระทบจะรู้สึกได้ในไม่ช้า


ช่องโซเดียมยังคงต่ออายุตัวเองด้วยหน่วยย่อยใหม่ที่สร้างโดยยีนหรือไม่? - ชีววิทยา

Channelopathies ของเซลล์ประสาทต้องการวิธีการรักษาแบบใหม่

แนวทางการบำบัดด้วยยีนที่ควบคุมความตื่นตัวของเครือข่ายอาจช่วยชีวิตโรคทางสมองเหล่านี้ได้

การแก้ไขยีนด้วย CRISPR/Cas9 สามารถแก้ไขการกลายพันธุ์ที่แฝงอยู่และรักษาโรคได้อย่างถาวร

ความก้าวหน้าในการส่งมอบยีนที่อาศัยไวรัสอาจอนุญาตให้มีการถ่ายทอดพื้นที่สมองขนาดใหญ่หลังการฉีดอย่างเป็นระบบ

ยีนบำบัดที่เหมาะสมที่สุดหรือกลยุทธ์การแก้ไขยีนจะขึ้นอยู่กับเมื่อสามารถให้การรักษาระหว่างการพัฒนาได้


เยื่อหุ้มเซลล์

ในตอนท้ายของส่วนนี้ คุณจะสามารถ:

  • อธิบายส่วนประกอบโมเลกุลที่ประกอบขึ้นเป็นเยื่อหุ้มเซลล์
  • อธิบายคุณสมบัติและคุณสมบัติที่สำคัญของเยื่อหุ้มเซลล์
  • แยกความแตกต่างระหว่างวัสดุที่สามารถและไม่สามารถแพร่กระจายผ่าน lipid bilayer
  • เปรียบเทียบและเปรียบเทียบการขนส่งแบบพาสซีฟประเภทต่างๆ กับการขนส่งแบบแอคทีฟ โดยให้ตัวอย่างของแต่ละประเภท

แม้จะมีความแตกต่างในโครงสร้างและหน้าที่ เซลล์ที่มีชีวิตทั้งหมดในสิ่งมีชีวิตหลายเซลล์มีเยื่อหุ้มเซลล์ล้อมรอบ เนื่องจากชั้นผิวชั้นนอกของคุณแยกร่างกายออกจากสิ่งแวดล้อม เยื่อหุ้มเซลล์ (หรือที่เรียกว่าเมมเบรนในพลาสมา) จะแยกเนื้อหาภายในของเซลล์ออกจากสภาพแวดล้อมภายนอก เยื่อหุ้มเซลล์นี้เป็นเกราะป้องกันรอบ ๆ เซลล์และควบคุมว่าวัสดุใดสามารถผ่านเข้าหรือออกได้


คุณสมบัติเฉพาะของ DHODH

โดด ยีนที่อยู่ในกรอบการอ่านแบบเปิด (ORF) ของโครโมโซมมนุษย์ 16q22 ที่มีความยาวเต็มที่ 1191 bp เข้ารหัสโปรตีน DHODH ด้วยลำดับกรดอะมิโน 397 ตัว [4] เอนไซม์ที่เป็นผลึกถือว่าประกอบด้วยฟลาวิน โมโนนิวคลีโอไทด์ (FMN), ฟลาวิน อะดีนีน ไดนิวคลีโอไทด์ (FAD) และธาตุเหล็ก [10]

ตามความคล้ายคลึงของลำดับและตำแหน่งย่อย DHODH แบ่งออกเป็น DHODH ระดับ 1 และ 2 DHODH คลาส 1 ที่ละลายน้ำได้จะถูกจำแนกเพิ่มเติมเป็นคลาส 1A, คลาส 1B และคลาส 1S ซึ่งทั้งหมดอยู่ในไซโตพลาสซึม คลาส 1A เป็นโปรตีนโฮโมไดเมอร์และพบในแบคทีเรียแกรมบวก DHODH คลาส 1B เป็นไดเมอร์ของเฮเทอโรไดเมอร์ และมักพบในแบคทีเรียแกรมบวกที่แพร่หลาย ซึ่งประกอบด้วยโปรตีนที่แตกต่างกันสองชนิด S DHODH เป็นชนิดที่เพิ่งค้นพบซึ่งไม่สามารถใช้ตัวรับอิเล็กตรอนตามธรรมชาติได้ ใช้ซีรีนเป็นเบสตัวเร่งปฏิกิริยา ซึ่งเป็นชนิดพิเศษสำหรับ cytosolic DHODH [5, 11] DHODH คลาส 2 เป็นโปรตีนโมโนเมอร์ที่ยึดติดกับเยื่อหุ้มชั้นในของไมโตคอนเดรียในยูคาริโอตและโปรคาริโอตบางชนิด [11,12,13,14] คลาส 1A และคลาส 1B มีความเหมือนกันของลำดับประมาณ 30% ในขณะที่ DHODH คลาส 1 ที่ละลายน้ำได้และคลาส 2 ที่จับกับเมมเบรนจะมีส่วนแบ่งประมาณ 20% ของความเหมือนกันของลำดับ [11]

DHODH ถูกแยกออกมาครั้งแรกในปี พ.ศ. 2496 จากสารสกัดจาก Clostridium oroticum (CoDHODH) [11, 15]. โครงสร้างผลึกแรกของฟลาวินที่มี DHODH ถูกกำหนดจาก แลคโตค็อกคัส แลคติส ในปี 1997 (LlDHODH) [16] และโครงสร้างของ DHODH ของมนุษย์ที่ซับซ้อนด้วยสารต่อต้านการงอกขยายได้รับการแก้ไขในปี 2000 การศึกษาโครงสร้างแสดงให้เห็นว่า DHODH มีสองโดเมน คือโดเมน C-terminal ขนาดใหญ่และโดเมน N-terminal ที่เล็กกว่า ซึ่งแนบมาด้วยลูปขยาย ปลาย N ขยายส่วนที่เหลือประมาณ 40 เรซิดิวเป็นสอง α-เฮลิซ (αA และ αB) ที่เชื่อมโยงกันโดยวงสั้นและเกี่ยวข้องกับการรวมตัวของเมมเบรน [11] เทอร์มินอล C ที่ใหญ่กว่า cytosolic มีไซต์รีดอกซ์ โดเมน N-terminal สร้างอุโมงค์ภายในเมมเบรนที่ซ่อนไซต์การจับ FMN [2, 9, 17] โดยเฉพาะอย่างยิ่ง องค์ประกอบโครงสร้างและสารตกค้างส่วนใหญ่ที่เกี่ยวข้องกับทั้ง FMN และการจับของซับสเตรตได้รับการอนุรักษ์ไว้ในคลาส 1 และ 2 ของ DHODH [11] Ubiquinone ใช้อุโมงค์เพื่อเข้าใกล้โคแฟกเตอร์ FMN สำหรับการมีส่วนร่วมในปฏิกิริยารีดอกซ์ สามารถแพร่กระจายไปยังเยื่อหุ้มชั้นในของไมโตคอนเดรียได้อย่างง่ายดาย [18, 19] Ubiquinone Q10 จับสัญญาณเปปไทด์ที่อยู่ในปลาย N ของ DHODH ซึ่งครอบคลุมสำหรับการนำเข้าไมโตคอนเดรียและเป็นโดเมนทรานส์เมมเบรนที่มีไมโครโดเมนทำปฏิกิริยากับเยื่อหุ้มชั้นในของไมโตคอนเดรีย [20, 21].


เชินไฮเมอร์, อาร์. สถานะไดนามิกขององค์ประกอบร่างกาย (สำนักพิมพ์มหาวิทยาลัยฮาร์วาร์ด เคมบริดจ์ แมสซาชูเซตส์ 2485)

ชิมเก้, อาร์.ที. & Doyle, D. การควบคุมระดับเอนไซม์ในเนื้อเยื่อของสัตว์ อันนุ. รายได้ Biochem. 39, 929–979 (1971).

Haider, M. & Segal, H.L. ลักษณะบางอย่างของระบบอะลานีนอะมิโนทรานสเฟอเรสและอาร์จิเนสที่ไม่ทำงานของไลโซโซม โค้ง. ไบโอเคมี. ชีวฟิสิกส์ 148, 228–237 (1972).

Hershko, A. & Tomkins, G.M. การศึกษาการเสื่อมสภาพของไทโรซีน อะมิโนทรานสเฟอเรสในเซลล์มะเร็งตับในวัฒนธรรม อิทธิพลขององค์ประกอบของการพึ่งพาสื่อและอะดีโนซีนไตรฟอสเฟต เจ. ไบโอล. เคมี. 246, 710–714 (1971).

ซิมป์สัน, เอ็ม.วี. การปล่อยกรดอะมิโนที่ติดฉลากออกจากโปรตีนในชิ้นตับ เจ. ไบโอล. เคมี. 201, 143–154 (1953).

Hershko, A. & Ciechanover, A. กลไกการสลายโปรตีนภายในเซลล์ อันนุ. รายได้ Biochem. 51, 335–364 (1982).

Etlinger, J.D. & amp Goldberg, A.L. ระบบสลายโปรตีนที่ขึ้นกับ ATP ที่ละลายน้ำได้ ซึ่งมีหน้าที่ในการย่อยสลายโปรตีนที่ผิดปกติใน reticulocytes Proc. แนท อคาเด วิทย์ สหรัฐอเมริกา. 74, 54–58 (1977).

Ciechanover, A., Hod, Y. & Hershko, A. ส่วนประกอบโพลีเปปไทด์ที่ทนความร้อนของระบบสลายโปรตีนที่ขึ้นกับ ATP จากเรติคูโลไซต์ ไบโอเคมี. ชีวฟิสิกส์ ความละเอียด คอมมูนิตี้ 81, 1100–1105 (1978).

Wilkinson, K.D. , Urban, เอ็ม.เค. & Haas, A.L. Ubiquitin เป็นปัจจัยการสลายโปรตีนที่ขึ้นกับ ATP ของ reticulocytes ของกระต่าย เจ. ไบโอล. เคมี. 255, 7529–7532 (1980).

โกลด์สตีน, G. et al. การแยกตัวของพอลิเปปไทด์ที่มีคุณสมบัติแตกต่างของลิมโฟไซต์และน่าจะแสดงให้เห็นในระดับสากลในเซลล์ที่มีชีวิต Proc. แนท อคาเด วิทย์ สหรัฐอเมริกา. 72, 11–15 (1975).

Goldknopf, อิลลินอยส์ & Busch, H. Isopeptide เชื่อมโยงระหว่าง nonhistone และ histone A โพลีเปปไทด์ของโครโมโซมคอนจูเกตโปรตีน A24 Proc. แนท อคาเด วิทย์ สหรัฐอเมริกา. 74, 864–868 (1977).

Ciechanover, A. , Heller, H. , Elias, S. , Haas, A. L. & Hershko, A. การผันตาม ATP ของโปรตีน reticulocyte ด้วยโพลีเปปไทด์ที่จำเป็นสำหรับการย่อยสลายโปรตีน Proc. แนท อคาเด วิทย์ สหรัฐอเมริกา. 77, 1365–1368 (1980).

Hershko, A. , Ciechanover, A, Heller, H. , Haas, A. L. & Rose, I. A. บทบาทที่เสนอของ ATP ในการสลายโปรตีน: การผันของโปรตีนที่มีหลายสายของโพลีเปปไทด์ของการสลายโปรตีนที่ขึ้นกับ ATP Proc. แนท อคาเด วิทย์ สหรัฐอเมริกา. 77, 1783–1786 (1980).

Lam, Y.A. , Xu, W. , DeMartino, G.N. &โคเฮน R.E. การแก้ไขคอนจูเกต ubiquitin โดย isopeptidase ของ 26S proteasome ธรรมชาติ 385, 737–740 (1997).

Hershko, A. & Ciechanover, A. ระบบ ubiquitin อันนุ. รายได้ Biochem. 67, 425–479 (1998).

Hershko, A. , Heller, H. , Elias, S. & Ciechanover, A. ส่วนประกอบของระบบ ligase ubiquitin-protein: ความละเอียด, การทำให้บริสุทธิ์ของสัมพรรคภาพและบทบาทในการสลายโปรตีน เจ. ไบโอล. เคมี. 258, 8206–8214 (1983).

Hershko, A. , Heller, A. , Eytan, E. & Reiss, Y. ไซต์การจับโปรตีนของระบบ ubiquitin-protein ligase เจ. ไบโอล. เคมี. 261, 11992–11999 (1986).

Hough, R. , Pratt, G. & Rechsteiner, คอนจูเกต M. Ubiquitin-lysozyme การระบุและการกำหนดลักษณะเฉพาะของโปรตีเอสที่ขึ้นกับ ATP จากกระต่ายเรติคูโลไซต์ไลเสต เจ. ไบโอล. เคมี. 261, 2400–2408 (1986).

Hershko, A. บทเรียนจากการค้นพบระบบ ubiquitin เทรนด์ไบโอเคม วิทย์ 21, 445–449 (1996).

Hershko, A. , Heller, H. , Ganoth, D. & Ciechanover, A. ใน การหมุนเวียนของโปรตีนและฟังก์ชันไลโซโซม (eds. Segal, H.L. & Doyle, D.J.) 149–169 (Academic Press, New York, 1978)

Ciechanover, A. , Elias, S. , Heller, H. , Ferber, S. & Hershko, A. การแสดงคุณลักษณะของโพลีเปปไทด์ที่ทนความร้อนได้ของระบบสลายโปรตีนที่ขึ้นกับ ATP จากเรติคูโลไซต์ เจ. ไบโอล. เคมี. 255, 7525–7528 (1980).

Wilkinson, K.D. , Urban, เอ็ม.เค. & Haas, A.L. Ubiquitin เป็นปัจจัยการสลายโปรตีนที่ขึ้นกับ ATP I ของ reticulocytes ของกระต่าย เจ. ไบโอล. เคมี. 255, 7529–7532 (1980).

Hershko, A. & Heller, H. การเกิดขึ้นของโครงสร้างโพลียูบิควิตินในคอนจูเกตโปรตีนยูบิควิติน ไบโอเคมี. ชีวฟิสิกส์ ความละเอียด ทั่วไป. 128, 1079–1086 (1985).

เชา V. et al. ห่วงโซ่ multiubiquitin ถูกจำกัดให้ไลซีนจำเพาะในโปรตีนอายุสั้นเป้าหมาย ศาสตร์ 243, 1576–1583 (1989).

Lipmann, F, Gevers, W. , Kleinkauf, H. & Roskoski, R. Jr. การสังเคราะห์โพลีเปปไทด์บนเทมเพลตโปรตีน: การสังเคราะห์ด้วยเอนไซม์ของ gramicidin S และ tyrocidine โฆษณา เอนไซม์ ญาติ. พื้นที่ โมล. ไบโอล. 35, 1–34 (1971).

Ciechanover, A. , Elias, S. , Heller, H. & Hershko, A. การทำให้บริสุทธิ์ "Covalent affinity" ของเอนไซม์กระตุ้น ubiquitin เจ. ไบโอล. เคมี. 257, 2537–2542 (1982).

Hershko, A. , Eytan, E. , Ciechanover, A. & Haas, A.L. การวิเคราะห์ทางอิมมูโนเคมีของการหมุนเวียนของคอนจูเกตโปรตีน ubiquitin ในเซลล์ที่ไม่บุบสลาย: ความสัมพันธ์กับการสลายตัวของโปรตีนที่ผิดปกติ เจ. ไบโอล. เคมี. 257, 13964–13970 (1982).

Finley, D., Ciechanover, A. & Varshavsky, A. . ความสามารถในการทนความร้อนของเอ็นไซม์ที่กระตุ้นยูบิควิตินจากวัฏจักรเซลล์กลายพันธุ์ ts85 ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม เซลล์ 37, 43–55 (1984).

Ciechanover, A. , Finley D. & amp Varshavsky, A. Ubiquitin การพึ่งพาอาศัยกันของการย่อยสลายโปรตีนแบบคัดเลือกที่แสดงให้เห็นในวัฏจักรเซลล์กลายพันธุ์ ts85 ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม เซลล์ 37, 57–66 (1984).

Ferber, S. & Ciechanover, A. Transfer RNA จำเป็นสำหรับการคอนจูเกตของ ubiquitin กับซับสเตรตที่เลือกของระบบโปรตีโอไลติกที่ขึ้นกับ ubiquitin และ ATP เจ. ไบโอล. เคมี. 261, 3128–3134 (1986).

Ferber, S. & Ciechanover, A. บทบาทของ arginine-tRNA ในการย่อยสลายโปรตีนโดยวิถีทาง ubiquitin ธรรมชาติ 326, 808–811 (1987).

Varshavsky, A. วิถี N-end ของการย่อยสลายโปรตีน เซลล์ยีน 2, 13–28 (1997).

Hershko, A. , Heller, H. , Eytan, E. , Kaklij, G. & Rose, I.A. บทบาทของโปรตีนกลุ่ม α-amino ในการสลายโปรตีนที่เป็นสื่อกลาง ubiquitin Proc. แนท อคาเด วิทย์ สหรัฐอเมริกา 81, 7021–7025 (1984).

Mayer, A. Siegel, N.R. , Schwartz, A.L. & Ciechanover, A. การเสื่อมสภาพของโปรตีนด้วยอะซิติเลตอะมิโนเทอร์มินีโดยระบบ ubiquitin ศาสตร์ 244, 1480–1483 (1989).

Scheffner, M. , Werness, B.A. , Huibregtse, J.M. , Levine, A.J. &ฮาวลีย์, P.M. E6 oncoprotein ที่เข้ารหัสโดย human papillomavirus type 16 และ 18 ส่งเสริมการย่อยสลายของ p53 เซลล์ 63, 1129–1136 (1990).

กลอตเซอร์, เอ็ม., เมอร์เรย์, เอ.ดับเบิลยู. & Kirschner M.W. Cyclin เสื่อมโทรมไปตามทางเดิน ubiquitin ธรรมชาติ 349, 132–138 (1991).

Hershko, A. , Ganoth, D. , Pehrson, J. , Palazzo, R.E. , & Cohen, L.H. . Methylated ubiquitin ยับยั้งการสลายตัวของ cyclin ในสารสกัดจากตัวอ่อนหอย เจ. ไบโอล. เคมี. 266, 16376–16379 (1991).

Ciechanover, A. และคณะ การเสื่อมสภาพของโปรตีนนิวเคลียสโดยระบบยูบิควิติน ในหลอดทดลอง. Proc. แนท อคาเด วิทย์ สหรัฐอเมริกา 88, 139–143 (1991).

Ciechanover, A. , Orian, A. & Schwartz, A.L.. การสลายโปรตีนที่อาศัย Ubiquitin: ระเบียบทางชีวภาพโดยการทำลาย เรียงความชีวภาพ 22, 442–451 (2000).

Yaron, A. และคณะ การยับยั้งการทำงานของเซลล์ NF-κBผ่านการกำหนดเป้าหมายเฉพาะของIκBα-ubiquitin ligase เอ็มบีโอ เจ 16, 6486–6494 (1997).

Butz, K. , Denk, C. , Ullmann, A. , Scheffner, M. & Hoppe-Seyler, F. การเหนี่ยวนำของอะพอพโทซิสในเซลล์มะเร็งที่เป็นบวกของมนุษย์ papillomavirus โดยเปปไทด์ aptamers ที่กำหนดเป้าหมายไวรัส E6 oncoprotein Proc. แนท อคาเด วิทย์ สหรัฐอเมริกา 97, 6693–6697 (2000).

Finley, D. , Özkaynak, E. & Varshavsky, A. ยีนของยีสต์ polyubiquitin จำเป็นต่อการทนต่ออุณหภูมิสูง ความอดอยาก และความเครียดอื่นๆ เซลล์ 48, 1035–1046 (1987).

Jentsch, S. , McGrath, J.P. & amp Varshavsky, A. ยีนซ่อมแซม DNA ของยีสต์ RAD6 เข้ารหัสเอ็นไซม์ที่คอนจูเกต ubiquitin ธรรมชาติ 329, 131–134 (1987).

โกเบล, เอ็ม.จี. และคณะ ยีนวัฏจักรเซลล์ยีสต์ CDC34 เข้ารหัสเอนไซม์คอนจูเกต ubiquitin ศาสตร์ 241, 1331–1335 (1988).

Finley, D. , Bartel, B. & Varshavsky, A. หางของสารตั้งต้นของ ubiquitin เป็นโปรตีนไรโบโซมที่หลอมรวมกับ ubiquitin ช่วยอำนวยความสะดวกในการสร้างชีวภาพของไรโบโซม ธรรมชาติ 338, 394–401 (1989).

Bachmair, A., Finley, D. & Varshavsky, A. ในร่างกาย ครึ่งชีวิตของโปรตีนเป็นหน้าที่ของเรซิดิวของปลายอะมิโน ศาสตร์ 234, 179–186 (1986).

Varshavsky, เทคนิคฟิวชั่น A. Ubiquitin และลูกหลานของมัน ปรุงยา เอนไซม์ 327, 578–593 (2000).

Varshavsky, A. กฎ N-end: ฟังก์ชั่น, ความลึกลับ, การใช้งาน Proc. แนท อคาเด วิทย์ สหรัฐอเมริกา 93, 12142–12149 (1996).

Johnson, E. S. , Ma, P. C. , Ota, I. M. & Varshavsky, A. เส้นทางการสลายโปรตีนที่รับรู้ ubiquitin เป็นสัญญาณการเสื่อมสภาพ เจ. ไบโอล. เคมี. 270, 17442–17456 (1995).

Suzuki, T. & Varshavsky, A. สัญญาณการเสื่อมสภาพในพื้นที่ลำดับไลซีน-แอสพาราจีน เอ็มบีโอ เจ 18, 6017–6026 (1999).

Varshavsky, A. ระบบ ubiquitin เทรนด์ไบโอเคม วิทย์ 22, 383–387 (1997).

Xie, Y. & Varshavsky, A. ความสัมพันธ์ทางกายภาพของ ubiquitin ligases และ 26S proteasome Proc. แนท อคาเด วิทย์ สหรัฐอเมริกา 97, 2497–2502 (2000).

จอห์นสัน อี.เอส. กอนดา ดี.เค. & Varshavsky, A. การรับรู้ Cis-trans และการย่อยสลายโปรตีนอายุสั้นเฉพาะหน่วยย่อย ธรรมชาติ 346, 287–291 (1990).

ควอน, Y.T. และคณะ กิจกรรมที่เปลี่ยนแปลงไป พฤติกรรมทางสังคม และความจำเชิงพื้นที่ในหนูที่ไม่มี NTAN1p amidase และสาขา asparagine ของเส้นทางกฎ N-end มล. เซลล์. ไบโอล. 20, 4135–4148 (2000).

ดาวิดอฟ, I.V. & Varshavsky, A. RGS4 ถูกอาร์จินีลและเสื่อมคุณภาพโดยวิถีกฎ N-end ในหลอดทดลอง เจ. ไบโอล. เคมี. 275, 22931–22941 (2000).

เบิร์ด ซี. เทิร์นเนอร์ จี.ซี. & Varshavsky, A. เส้นทางกฎ N-end ควบคุมการนำเข้าเปปไทด์ผ่านการย่อยสลายของตัวยับยั้งการถอดรหัส เอ็มบีโอ เจ 17, 269–277 (1998).

Turner, G., Du, F. & Varshavsky, A. Peptides เร่งการดูดซึมโดยเปิดใช้งานเส้นทางสลายโปรตีนที่ขึ้นกับ ubiquitin ธรรมชาติ 405, 579–582 (2000).


Electrophysiological Studies โดยใช้ hiPSC-CMs: ข้อควรพิจารณาทางเทคนิค

มีวิธีการรุกรานและไม่รุกรานที่หลากหลายสำหรับการวิเคราะห์ทางไฟฟ้าฟิสิกส์ของ hiPSC-CM ซึ่งรวมถึงวิธีการปะติดปะต่อและการวัดอิเล็กโทรดที่คมชัด อาร์เรย์หลายอิเล็กโทรด (MEA) และการเรืองแสงที่ไวต่อแรงดันไฟฟ้า (รูปที่ 2) แต่ละเทคนิคมีจุดแข็งและข้อจำกัดเฉพาะในการวิจัย hiPSC-CMs ตามที่อธิบายในรายละเอียดเพิ่มเติมด้านล่าง

เทคนิคการหนีบปะ

เทคนิคแคลมป์แพตช์นั้นใช้แรงงานค่อนข้างมาก และต้องใช้ผู้ปฏิบัติงานที่มีทักษะและมีประสบการณ์ อย่างไรก็ตาม ถือว่าเป็นมาตรฐานทองคำสำหรับการวิจัยทางไฟฟ้าฟิสิกส์ เนื่องจากเป็นวิธีที่ให้ข้อมูลมากที่สุด ทำให้สามารถบันทึกทั้งกระแสเมมเบรนและพารามิเตอร์ AP (รูปที่ 1b และ 2a) [80] โดยอาศัยการกดปิเปตแก้วที่ค่อนข้างทื่อ (2-4 MΩ) เบาๆ กับเยื่อหุ้มเซลล์ จากนั้นจึงดูดดูดเพื่อให้ได้ซีลรูปทรงโอเมก้าที่มีความต้านทานสูง หลังจากเข้าถึงเซลล์แล้ว จะได้รับ "การกำหนดค่าแคลมป์ทั้งเซลล์" ซึ่งช่วยให้สามารถวัด AP และกระแสเมมเบรนในแคลมป์ "กระแส" และ "แรงดัน" ตามลำดับ เทคนิคแคลมป์ตัวปะต่อสามารถทำได้ด้วยตนเอง (การวางตำแหน่งปิเปตด้วยความช่วยเหลือของไมโครแมนิพัลเตอร์) หรือด้วยเทคนิคที่เรียกว่าแพทช์แคลมป์อัตโนมัติ [81,82,83] (ดูหัวข้อ “แคลมป์แพทช์อัตโนมัติ”)

แคลมป์ปัจจุบัน

ในโหมดแคลมป์ปัจจุบัน กระแสที่ฉีดผ่านปิเปตแพตช์จะถูกควบคุมในขณะที่บันทึกศักย์ของเมมเบรนที่ทำงานอิสระของเซลล์ แคลมป์ปัจจุบันช่วยให้สามารถวัดค่า AP ที่อาจเกิดขึ้นเองตามธรรมชาติหรือเพื่อตอบสนองต่อกระแสกระตุ้นที่ฉีดผ่านปิเปตแพทช์ ประชากรของ hiPSC-CMs มักประกอบด้วยเซลล์ที่ตีเองและเซลล์ที่สงบ ในการศึกษาส่วนใหญ่จะเลือกการตี hiPSC-CM ตามธรรมชาติเพื่อวัด AP เนื่องจากเซลล์ที่ตีถือเป็น CM อย่างไรก็ตาม การเอาชนะ hiPSC-CMs ที่เกิดขึ้นเองนั้นมักถูกขั้วและมีเฟสดีโพลาไรเซชันไดแอสโตลิก (เฟส 4) ซึ่งจะทำให้ศักยภาพของเมมเบรนลดลงอีกประมาณ -40 mV ก่อนเริ่มมีอาการ AP การสลับขั้วขนาดใหญ่ดังกล่าวจะหยุดการทำงานของกระแสเมมเบรนต่างๆ เช่น ผม นา, และ ผม ถึง1และเพิ่มความสำคัญของ ผม Ks และ ผม กรุ ในการกำหนดศักย์เยื่อไดแอสโตลิก [84] เพื่อเอาชนะข้อ จำกัด เหล่านี้บางส่วน ในการศึกษาบางอย่างที่หยุดนิ่ง hiPSC-CM ที่สามารถหดตัวจากการกระตุ้นภาคสนามได้รับการคัดเลือกโดยเฉพาะสำหรับการวิเคราะห์ [31] อย่างไรก็ตาม การเลือกเซลล์ด้วยวิธีนี้มีความท้าทายทางเทคนิคและใช้เวลานาน

เพื่อให้ได้คอนฟิกูเรชันทั้งเซลล์ อาจใช้วิธีการแพตช์แคลมป์ "ทั้งเซลล์" ที่แตกออกหรือเจาะรู แม้ว่าโดยทั่วไปการเข้าถึงเซลล์จะดีกว่าในแพทช์ที่แตก แต่ Ca 2+ -buffer (เช่น EGTA) มักจะถูกเพิ่มลงในสารละลายปิเปตเมื่อใช้เทคนิคนี้ ซึ่งอาจปรับการหมุนเวียนของ Ca 2+ ภายในเซลล์ และส่งผลต่อการหดตัวของหัวใจ สัณฐานวิทยาของ AP , และระบบอัตโนมัติใน hiPSC-CMs ผ่านช่องไอออนและตัวแลกเปลี่ยนที่ไวต่อ Ca 2+ [85] นี่เป็นปัญหาน้อยกว่าเมื่อใช้เทคนิคแพทช์เจาะรู ซึ่งให้รูปคลื่น AP ที่เสถียรมากขึ้นเมื่อเวลาผ่านไป ในการศึกษา hiPSC-CMs สามารถใช้เทคนิคการหนีบในปัจจุบันเพื่อวัด AP จากเซลล์เดี่ยวและจากคลัสเตอร์ [86] อย่างไรก็ตาม คลัสเตอร์ hiPSC-CMs อาจมีประชากรผสมกันของ "atrial-like", "ventricular-like" และ "nodal-like" CMs รวมทั้งเซลล์ที่ไม่ใช่ cardiomyocytes และการมีเพศสัมพันธ์ระหว่าง hiPSC-CMs กับเซลล์หลัง อาจส่งผลต่อระยะการสลับขั้วและการเปลี่ยนขั้วของ AP ข้อควรพิจารณาเหล่านี้ต้องนำมาพิจารณา

แคลมป์แรงดัน

ในโหมดแคลมป์แรงดัน ศักย์ของเมมเบรนจะอยู่ที่ระดับแรงดันที่ตั้งไว้ผ่านแอมพลิฟายเออร์แคลมป์วงจรป้อนกลับ ซึ่งช่วยให้สามารถบันทึกกระแสเมมเบรนสุทธิที่ศักย์ของเมมเบรนที่กำหนด การใช้โปรโตคอลแคลมป์แรงดันไฟฟ้าเฉพาะ ความหนาแน่นกระแสไอออน (กำหนดเป็นกระแสหารด้วยขนาดเซลล์) และคุณสมบัติทางสรีรวิทยาต่างๆ เช่น การพึ่งพาแรงดันไฟฟ้าของการเปิดใช้งาน (ใน) การฟื้นตัวจากการหยุดทำงาน การหยุดทำงานช้า และความเร็วของการเปิดใช้งานและการปิดใช้งานกระแสไฟ (ใน) สามารถศึกษาในเซลล์เดี่ยวภายใต้สภาวะที่มีการควบคุมอย่างระมัดระวัง (ดูเพิ่มเติมในหัวข้อ “ลักษณะทางไฟฟ้าของ hiPSC-CMs”)

ที่หนีบแพทช์อัตโนมัติ

แม้ว่าเทคนิคแคลมป์แบบใช้มือ (ตามที่อธิบายไว้ในส่วน "แคลมป์กระแส" และ "แคลมป์แรงดัน") ถือเป็นมาตรฐานทองคำสำหรับการศึกษาทางไฟฟ้าฟิสิกส์ ขั้นตอนการทดลองอาจซับซ้อนและใช้เวลานาน ส่งผลให้มีปริมาณงานต่ำ ในทางตรงกันข้าม โปรแกรมแก้ไขอัตโนมัติโดยอนุญาตให้บันทึกหลายรายการพร้อมกัน สามารถเพิ่มปริมาณข้อมูลได้ 10 ถึง 100 เท่า ขึ้นอยู่กับช่องไอออนที่อยู่ระหว่างการตรวจสอบและแพลตฟอร์มที่ใช้ [16] ด้วยแคลมป์ปะแบบอัตโนมัติ ปิเปตแก้วแบบเดิมจะถูกแทนที่ด้วยรูรับแสงที่ด้านล่างของบ่อน้ำ ซึ่งแรงดันลบที่นำไปใช้จะปะติดปะต่อเยื่อหุ้มเซลล์ แม้ว่าวิธีนี้จะทำให้กระบวนการแพตช์แคลมป์เป็นระบบอัตโนมัติ เทคนิคอัตโนมัตินี้ต้องการสารแขวนลอยเซลล์เดียวคุณภาพสูง ความหนาแน่นสูง และเป็นเนื้อเดียวกัน [81,82,83] ซึ่งอาจเป็นเรื่องที่ท้าทายเนื่องจาก hiPSC-CMs ค่อนข้างแพงในการผลิตบน ขนาดใหญ่และมีความไวสูงต่อการแตกตัวของเอนไซม์เป็นเซลล์เดียว นอกจากนี้ เทคนิคการปะแก้อัตโนมัติไม่อนุญาตให้เลือกเซลล์ที่จะวัด เช่น คาร์ดิโอไมโอไซต์ที่ได้มาจาก hiPSC เทียบกับไฟโบรบลาสต์ หรือ hiPSC-CM ที่ติดฉลากด้วย GFP หลังจากการถ่ายไวรัสหรือวิธีการทางพันธุกรรมอื่นๆ มาและคณะ เปรียบเทียบแพตช์แบบแมนนวลและแบบอัตโนมัติใน hiPSC-CM และรายงานอัตราความสำเร็จแบบแปรผันสำหรับการวิเคราะห์แพตช์แคลมป์อัตโนมัติแบบระนาบด้วยการบันทึกที่ยอมรับได้ใน

50% ของการวัด พวกเขาสังเกตเห็นความแตกต่างในความหนาแน่นกระแสและความจุของเซลล์ระหว่างเซลล์แบบอัตโนมัติและแบบแพตช์ด้วยตนเอง [30] ความแตกต่างที่สังเกตได้เหล่านี้บางส่วนอาจเป็นผลมาจากโปรโตคอลการแยกตัวของ hiPSC-CMs ที่ใช้สำหรับการทดลองแบบใช้แพทช์แคลมป์แบบแมนนวลกับแบบอัตโนมัติสำหรับช่วงหลัง มักใช้ทริปซินซึ่งอาจส่งผลต่อคุณภาพการบันทึกโดยส่งผลกระทบต่อโปรตีนเมมเบรน [87] การใช้โปรโตคอลการแยกตัวแบบสองขั้นตอนทางเลือก (ประกอบด้วยการแยกตัวของทริปซิน การเพาะใหม่ที่ความหนาแน่นต่ำ และการเก็บเกี่ยวใหม่โดยการแยกส่วนอย่างอ่อนโยนด้วยแอคคิวเตส) Rajamohan และเพื่อนร่วมงานสามารถเพิ่มจำนวนการบันทึกอัตโนมัติที่ประสบความสำเร็จ [88] ดังนั้น การวิเคราะห์ทางไฟฟ้าฟิสิกส์ของ hiPSC-CMs โดยใช้วิธีการแก้ไขอัตโนมัติปริมาณงานสูงจึงเป็นไปได้ [30, 88] แต่ต้องมีการพิจารณาข้อจำกัดบางประการ

การวัดไมโครอิเล็กโทรดที่คมชัด

เทคนิคไมโครอิเล็กโทรดที่คมชัดภายในเซลล์เป็นเครื่องมือแบบดั้งเดิมและเป็นที่ยอมรับในการวัดแรงดันไฟหรือกระแสไฟฟ้าที่แม่นยำที่ไหลผ่านเมมเบรน ตรงกันข้ามกับเทคนิคการปะติดปะต่อ เซลล์หรือเนื้อเยื่อถูกเสียบด้วยไมโครอิเล็กโทรดแก้วแบบแหลมหนึ่งหรือสองตัว (>30 MΩ) ซึ่งเต็มไปด้วยสารละลาย K + ที่ค่อนข้างไม่เกี่ยวกับสรีรวิทยา ต้องใช้อิเล็กโทรดสองตัวเพื่อทำการทดลองแคลมป์แรงดัน แต่อิเล็กโทรดหนึ่งตัวก็เพียงพอสำหรับการวัดแคลมป์กระแส การสอดแทรกของไมโครอิเล็กโทรดเข้าไปในเซลล์และ/หรือเนื้อเยื่ออาจส่งผลให้เกิดความเสียหายและส่งผลให้เซลล์ที่มีขนาดเล็กกว่าเกิดการสลับขั้วของเมมเบรน (กล่าวคือ hiPSC-CM) มีความไวต่อข้อจำกัดที่อาจเกิดขึ้นนี้มากกว่า เทคนิคอิเล็กโทรดที่คมชัดมักใช้เพื่อบันทึก AP จากคลัสเตอร์ hiPSC-CMs และด้วยเหตุนี้จึงเกี่ยวข้องกับข้อจำกัดที่อาจเกิดขึ้นของเซลล์แบบผสมภายในคลัสเตอร์เหล่านี้

อาร์เรย์หลายอิเล็กโทรด

แม้ว่าตัวหนีบภายในเซลล์และวิธีการไมโครอิเล็กโทรดที่คมชัดจะสร้างข้อมูล AP และเมมเบรนคุณภาพสูง แต่ก็ถือว่าลำบากและใช้เวลานานด้วยปัญหาทางเทคนิคหลายประการที่อาจขัดขวางการบันทึกที่ประสบความสำเร็จ นอกเหนือจากโปรแกรมแก้ไขอัตโนมัติแล้ว การวัดแบบไม่รุกรานของสัญญาณนอกเซลล์ด้วย MEA ยังถูกนำมาใช้มากขึ้นในการวิจัย hiPSC-CMs จากสัญญาณไฟฟ้า (ศักย์สนาม, FPs) ความถี่ในการตีและระยะเวลาศักย์สนาม (FPD) ซึ่งถือว่าคล้ายกับช่วง QT และระยะเวลา AP สามารถกำหนดได้ (รูปที่ 2b) MEAs อนุญาตให้วัด FPs ในระยะยาวจากคลัสเตอร์และโมโนเลเยอร์ของ hiPSC-CMs และมักใช้ในการทดสอบสารประกอบ (ใหม่) หรือความบกพร่องทางพันธุกรรม โดยเฉพาะอย่างยิ่งในส่วนที่สัมพันธ์กับผลกระทบต่อ AP repolarization และช่วง QT [59, 89] การวัดค่า MEA มักดำเนินการในกลุ่มบีตและโมโนเลเยอร์ที่เกิดขึ้นเอง และการตั้งค่า MEA บางส่วนได้ใช้วิธีการกระตุ้นด้วยไฟฟ้า ดังนั้น การวัดส่วนใหญ่จะดำเนินการบนเนื้อเยื่อหลายเซลล์ซึ่งไม่ได้กำหนดจังหวะที่ความถี่คงที่ และด้วยเหตุนี้ สารประกอบที่เปลี่ยนความยาวของวงจรจึงอาจส่งผลถึงคุณลักษณะที่อาจเกิดขึ้นของสนามโดยอ้อม เพื่อทำให้ค่าความแตกต่างของอัตราการเต้นเป็นปกติ โดยปกติช่วง QT จะได้รับการแก้ไขโดยใช้สูตร Bazett หรือ Fridericia แม้ว่าการแก้ไขประเภทนี้จะมีประสิทธิภาพในผู้ป่วย แต่อาจไม่ถูกต้องในสภาวะในหลอดทดลองดังกล่าว [14]. นอกจากนี้ ในการทดลองของ MEA เป็นการยากที่จะแยกแยะระหว่างผลกระทบโดยตรงของสารประกอบและข้อบกพร่องทางพันธุกรรมต่อ FPD หรือผลกระทบทางอ้อมผ่านการเปลี่ยนแปลงพารามิเตอร์ AP อื่นๆ เช่น MDP เนื่องจากไม่สามารถรับข้อมูลเกี่ยวกับสิ่งหลังได้ง่ายๆ โดยใช้เทคนิคนี้ [90] นอกจากนี้ เซลล์ประเภทต่างๆ และการมีเพศสัมพันธ์ระหว่าง CM ในการเตรียมหลายเซลล์อาจทำให้การกำหนดผลกระทบที่แม่นยำลดลง นอกจากนี้ hiPSC-CMs ที่วัดด้วย MEA มีความไวต่อสารประกอบน้อยกว่าเซลล์เดี่ยว [59] แต่นี่เป็นการค้นพบทั่วไปในการเตรียมหลายเซลล์ สุดท้าย MEAs ไม่อนุญาตให้มีการประเมินพารามิเตอร์ทางชีวฟิสิกส์ของกระแสไอออนจำเพาะ ซึ่งเป็นข้อกำหนดเบื้องต้นในการประเมินแนวทางการรักษาที่เป็นไปได้ (ใหม่) สำหรับความผิดปกติที่สืบทอดมา ในทางกลับกัน เวลาเปิดใช้งานในพื้นที่สามารถกำหนดได้ที่อิเล็กโทรดแต่ละขั้วภายใน MEA ซึ่งช่วยให้สร้างแผนที่การเปิดใช้งานโดยละเอียดและการวัดความเร็วการนำไฟฟ้า อย่างไรก็ตาม ความเร็วการนำไฟฟ้าในโมโนเลเยอร์ hiPSC-CMs นั้นค่อนข้างช้า (10–20 ซม./วินาที เมื่อเทียบกับ 60 ซม./วินาทีในช่องท้องด้านซ้ายของมนุษย์ที่โตเต็มวัย) [91, 92] ซึ่งน่าจะเกิดจากความแตกต่างใน ผม นา การกระจายและความพร้อมใช้งาน การกระจาย Connexin และสัณฐานวิทยาและเรขาคณิตของ hiPSC-CM (ดู [15])

การวัดเรืองแสง

อีกวิธีหนึ่งที่ไม่รุกรานเพื่อประเมินกิจกรรมทางไฟฟ้าในลักษณะที่มีปริมาณงานสูงคือผ่านการเรืองแสงที่ไวต่อแรงดันไฟฟ้า สำหรับสิ่งนี้ สามารถโหลด hiPSC-CM ได้ ตัวอย่างเช่น ด้วยสีย้อมไวต่อแรงดันไฟฟ้า di-4-ANEPPS [93] สามารถใช้การเรืองแสงของแรงดันไฟฟ้าเพื่อหาปริมาณความเร็วการนำไฟฟ้าในการเตรียมหลายเซลล์ เช่นเดียวกับพารามิเตอร์ AP ใน hiPSC-CM หรือคลัสเตอร์ที่แยกได้ สำหรับการเตรียมและการจัดกลุ่มหลายเซลล์ ควรคำนึงถึงข้อเสียที่อาจเกิดขึ้นจากผลกระทบของการมีเพศสัมพันธ์ การเปลี่ยนแปลง MDP และกิจกรรมที่เกิดขึ้นเองที่กล่าวถึงข้างต้น นอกจากนี้ จำเป็นต้องมีการป้องกันสิ่งประดิษฐ์จากการเคลื่อนไหวเพื่อรับสัญญาณที่เสถียร ดังนั้นจึงมักใช้ตัวยับยั้งการทำงานร่วมกันของไมโอซิน-แอคติน เช่น 2,3-บิวเทนไดโอนโมโนไซม์ (BDM) อย่างไรก็ตาม ทั้ง BDM และสีย้อมที่ไวต่อแรงดันไฟฟ้าอาจส่งผลกระทบต่อคุณสมบัติทางไฟฟ้าพื้นฐาน ใน hiPSC-CMs สามารถศึกษาคุณสมบัติการจัดการแคลเซียมเพิ่มเติมได้โดยใช้สีย้อมที่ไวต่อแคลเซียม เช่น Fluo-2AM หรือ Indo-1AM [44, 79] อย่างไรก็ตาม สีย้อมเรืองแสงสามารถเป็นพิษต่อแสงได้ ดังนั้นจึงไม่เหมาะสำหรับการบันทึกเป็นเวลานาน อีกทางหนึ่ง สามารถใช้ hiPSC-CMs ที่ดัดแปลงพันธุกรรมซึ่งแสดงตัวบ่งชี้การเรืองแสงของแรงดันไฟฟ้า (ArcLight) ซึ่งมีข้อได้เปรียบที่สามารถวัดชนิดเซลล์ hiPSC-CMs จำเพาะได้โดยใช้โปรโมเตอร์จำเพาะสำหรับการแสดงออกมากเกินไป [94] ในขณะที่วิธีการเรืองแสงอาจถูกนำไปใช้สำหรับการประเมินปริมาณงานสูงในขั้นต้นของสารประกอบ (การคัดกรองยาใหม่และ/หรือการทดสอบความปลอดภัยของหัวใจ) [95] สิ่งเหล่านี้ไม่ได้ให้ข้อมูลเกี่ยวกับคุณลักษณะของกระแสไอออน นอกจากนี้ การขาดค่าอ้างอิง (เช่น ระดับ 0 mV) เป็นข้อเสียเปรียบที่สำคัญ เนื่องจากอาจตรวจไม่พบการแปรผันเล็กน้อยใน MDP แต่ยังคงส่งผลกระทบอย่างมีนัยสำคัญต่อความพร้อมใช้งานของช่องไอออนและคุณลักษณะ AP ตามที่ผู้อื่นได้อภิปรายในรายละเอียดเพิ่มเติมเมื่อเร็วๆ นี้ [96] ,97,98].

แนวทางสำหรับการวัดทางไฟฟ้าสรีรวิทยาที่ดีขึ้นใน hiPSC-CMs

เทคนิคทั้งหมดที่อธิบายไว้ข้างต้นสามารถนำมาใช้สำหรับการศึกษาทางเภสัชวิทยาในการวิจัย hiPSC-CMs โดยคำนึงถึงข้อดีและข้อเสียของวิธีการต่างๆ ข้อเสียประการหนึ่งคือกลุ่มและโมโนเลเยอร์ของ hiPSC-CMs อาจมีเซลล์ที่ไม่ใช่คาร์ดิโอไมโอไซต์ซึ่งส่งผลต่อคุณสมบัติทางไฟฟ้าฟิสิกส์ [99] อย่างไรก็ตาม ทุกวันนี้ มีวิธีการต่างๆ มากมายในการทำให้ประชากรของ hiPSC-CM บริสุทธิ์อย่างสูง ซึ่งรวมถึงวิธีการคัดเลือก puromycin และ blasticidin [30, 99] การบำบัดด้วยแลคเตท [100] และการคัดแยกเซลล์ตามการเรืองแสง [101] ห้องปฏิบัติการวิจัยหลายแห่งกำลังใช้แนวทางที่มุ่งปรับปรุงการเจริญเติบโตทางโครงสร้างและหน้าที่ของ hiPSC-CMs ตัวอย่างเช่น การเพิ่มเวลาในการเพาะเลี้ยง สารเติมแต่งปานกลาง การกระตุ้นด้วยไฟฟ้า การยืดและ/หรือโหลดทางกล การใช้พอลิเมอร์ และการเพาะเลี้ยง 3 มิติ ได้รับการแสดงเพื่อปรับปรุงการจัดระเบียบ sarcomeric การจัดการแคลเซียมภายในเซลล์ การหดตัว และพารามิเตอร์อิเล็กโตรกายภาพวิทยา รวมทั้ง MDP และความเร็วการพุ่งขึ้น (ดู [15, 16, 20, 21]) นอกจากนี้ ข้อจำกัดบางประการมีอยู่ในการขาด ผม K1 ใน hiPSC-CMs ทำให้เกิดกิจกรรมที่เกิดขึ้นเอง ศักย์ของเมมเบรนแบบขั้วไฟฟ้า และความยากลำบากในการกำหนดจังหวะของเซลล์ที่ความถี่ที่ต้องการ เพื่อเอาชนะสิ่งนี้ หลายกลุ่มได้ใช้การเพิ่มประสิทธิภาพเทียมของ ผม K1 ความหนาแน่นผ่านการแสดงออกมากเกินไปของไวรัสของ Kir2.1 ช่องนำ ผม K1 [102, 103] หรือโดยการฉีดซิลิโค ผม K1 ด้วยจลนพลศาสตร์ของ Kir2.1 [68, 104] (รูปที่ 3a–c) การแสดงออกมากเกินไปของ Kir2.1 ใน hESC-CMs [102] ยกเลิกการทำงานอัตโนมัติของเซลล์ ทำให้แสดงลักษณะ AP คล้ายกับของ CM สำหรับผู้ใหญ่ อย่างไรก็ตาม เซลล์เหล่านี้ยังคงแสดงคุณสมบัติการจัดการ Ca 2+ ที่ยังไม่บรรลุนิติภาวะและการแสดงออกที่ลดลงของโปรตีนที่หดตัวถูกรายงาน[102] ในทางตรงกันข้าม บังคับการแสดงออกของ Kir2.1 ใน hiPSC-CMs ปรับปรุงทั้งคุณสมบัติชั่วคราวของ AP และ Ca 2+ [103] วิธีการนี้อาจมีประโยชน์โดยเฉพาะสำหรับ MEA และการวัดการเรืองแสงที่ไวต่อแรงดันไฟฟ้า แม้ว่าความแปรปรวนในระดับการแสดงออกที่มากเกินไปของ Kir2.1 อาจช่วยเพิ่มความแตกต่างได้ วิธีที่สองนำมาซึ่งการเพิ่มขึ้น ผม K1 ผ่านการฉีดซิลิโคของกระแสที่มีคุณสมบัติคล้ายกันโดยใช้เทคนิคแคลมป์ไดนามิก [105] เบตต์และเพื่อนร่วมงานเป็นคนแรกที่ใช้ "การแสดงออกทางอิเล็กทรอนิกส์" ของ ผม K1 ในการทดลอง hiPSC-CMs [104] ไม่นานมานี้ กลุ่มของเราได้ตรวจสอบการฉีดซิลิโคในขนาดต่างๆ ของ ผม K1 ใน hiPSC-CMs ที่อุณหภูมิทางสรีรวิทยา [68] (รูปที่ 3a–c) ในการศึกษาทั้งสองได้ปรับปรุง ผม K1 ทำให้เกิด RMP ทางสรีรวิทยาและมีเสถียรภาพมากขึ้น สัณฐานวิทยาของ AP คล้ายกระเป๋าหน้าท้อง และเพิ่มความเร็วการขึ้นจังหวะของ AP [68, 104] ดังนั้นในซิลิโค ผม K1 การฉีดถือเป็นเครื่องมือที่มีประสิทธิภาพสำหรับการวัด AP ที่ได้รับการปรับปรุงใน hiPSC-CM

ผลกระทบของ ผม K1 การฉีดด้วยศักย์ไดแอสโตลิกสูงสุด (MDP) และความเร็วสูงสุดในการขึ้นจังหวะ (dV/dt max) ใน hiPSC-CM NS ตัวอย่างที่เป็นตัวแทนของการติดตามศักยภาพการดำเนินการที่บันทึกจาก hiPSC-CMs เมื่อมีการฉีดขนาดที่เพิ่มขึ้นของการจำลอง ผม K1 โดยใช้แคลมป์ไดนามิก ผลกระทบของ ผม K1 การฉีดที่แอมพลิจูดต่างกันบน MDP และ dV/dtmax แสดงในพาเนล NS และ , ตามลำดับ (*NS < 0.05) หุ่นจำลองจาก [68]


เบาะแสใหม่เกี่ยวกับพลวัตโครงสร้างของช่อง BK

ช่อง BK (ช่องสัญญาณ K+ ที่มีการนำไฟฟ้ามาก, Ca2+ ขึ้นอยู่กับ K+) มีความจำเป็นสำหรับการควบคุมกระบวนการทางชีววิทยาที่สำคัญ เช่น กล้ามเนื้อเรียบและความตื่นเต้นง่ายของเส้นประสาท การวิจัยใหม่แสดงให้เห็นว่าการเปิดใช้งานช่อง BK เกี่ยวข้องกับการจัดเรียงโครงสร้างที่แต่ก่อนไม่เข้าใจ

การศึกษาปรากฏในฉบับเดือนสิงหาคม 2554 ของ วารสารสรีรวิทยาทั่วไป.

การวิจัยก่อนหน้านี้ชี้ให้เห็นถึงทฤษฎีที่เป็นไปได้ของการรวมเกตของการเปิดใช้งานในช่อง K+ โดยที่ "เกตการเปิดใช้งาน" เกิดขึ้นจากการข้ามมัดของเกลียวเมมเบรน S6 สี่ตัวจากหน่วยย่อยทั้งสี่ อย่างไรก็ตาม การศึกษาล่าสุดได้แนะนำโครงสร้างที่แตกต่างกันสำหรับช่อง BK แต่ตำแหน่งที่แน่นอนของประตูเปิดใช้งานยังคงเป็นปริศนา

การศึกษาใหม่โดย Xixi Chen และ Richard Aldrich (The University of Texas at Austin) ให้ข้อมูลที่สำคัญสำหรับคำถามนี้ การวิจัยระบุว่ามีสารตกค้าง M314 อยู่ครึ่งทางของ S6 ซึ่งดูเหมือนว่าจะเปลี่ยนรูปแบบในระหว่างการเปิดช่อง BK โดยหมุนห่วงโซ่ด้านข้างจากตำแหน่งในสถานะปิดที่ไม่สัมผัสกับรูพรุนที่ชอบน้ำไปยังส่วนที่เปิดเผยใน สถานะเปิด ผลลัพธ์เพิ่มเติมแสดงให้เห็นว่า M314 อาจไม่ได้เป็นส่วนหนึ่งของประตูกระตุ้นที่ปิดกั้นทางเดินของไอออน แต่การเคลื่อนไหวในรูลึกอาจจำเป็นสำหรับการปิดกั้นทางเดินของไอออนในส่วนอื่นของช่อง

The findings point to new directions for research regarding the molecular mechanisms of BK channel activation, according to Commentary by Daniel Cox (Tufts University School of Medicine) and Toshinori Hoshi (University of Pennsylvania). Importantly, they say, the study demonstrates that BK channel activation is not an open-and-shut case as previously suspected.


Organelles for Energy Production and Detoxification

In addition to the jobs performed by the endomembrane system, the cell has many other important functions. Just as you must consume nutrients to provide yourself with energy, so must each of your cells take in nutrients, some of which convert to chemical energy that can be used to power biochemical reactions. Another important function of the cell is detoxification. Humans take in all sorts of toxins from the environment and also produce harmful chemicals as byproducts of cellular processes. Cells called hepatocytes in the liver detoxify many of these toxins.

Mitochondria

NS ไมโตคอนเดรีย (plural = mitochondria) is a membranous, bean-shaped organelle that is the “energy transformer” of the cell. Mitochondria consist of an outer lipid bilayer membrane as well as an additional inner lipid bilayer membrane (Figure 6). The inner membrane is highly folded into winding structures with a great deal of surface area, called cristae. It is along this inner membrane that a series of proteins, enzymes, and other molecules perform the biochemical reactions of cellular respiration. These reactions convert energy stored in nutrient molecules (such as glucose) into adenosine triphosphate (ATP), which provides usable cellular energy to the cell. Cells use ATP constantly, and so the mitochondria are constantly at work. Oxygen molecules are required during cellular respiration, which is why you must constantly breathe it in. One of the organ systems in the body that uses huge amounts of ATP is the muscular system because ATP is required to sustain muscle contraction. As a result, muscle cells are packed full of mitochondria. Nerve cells also need large quantities of ATP to run their sodium-potassium pumps. Therefore, an individual neuron will be loaded with over a thousand mitochondria. On the other hand, a bone cell, which is not nearly as metabolically-active, might only have a couple hundred mitochondria.

Figure 6. Mitochondrion. The mitochondria are the energy-conversion factories of the cell. (a) A mitochondrion is composed of two separate lipid bilayer membranes. Along the inner membrane are various molecules that work together to produce ATP, the cell’s major energy currency. (b) An electron micrograph of mitochondria. EM × 236,000. (Micrograph provided by the Regents of University of Michigan Medical School © 2012)

การเชื่อมต่อวิวัฒนาการ

เอนโดซิมไบโอซิส

We have mentioned that both mitochondria and chloroplasts contain DNA and ribosomes. Have you wondered why? Strong evidence points to endosymbiosis as the explanation.

Symbiosis is a relationship in which organisms from two separate species depend on each other for their survival. Endosymbiosis (endo- = “within”) is a mutually beneficial relationship in which one organism lives inside the other. Endosymbiotic relationships abound in nature. We have already mentioned that microbes that produce vitamin K live inside the human gut. This relationship is beneficial for us because we are unable to synthesize vitamin K. It is also beneficial for the microbes because they are protected from other organisms and from drying out, and they receive abundant food from the environment of the large intestine.

Scientists have long noticed that bacteria, mitochondria, and chloroplasts are similar in size. We also know that bacteria have DNA and ribosomes, just like mitochondria and chloroplasts. Scientists believe that host cells and bacteria formed an endosymbiotic relationship when the host cells ingested both aerobic and autotrophic bacteria (cyanobacteria) but did not destroy them. Through many millions of years of evolution, these ingested bacteria became more specialized in their functions, with the aerobic bacteria becoming mitochondria and the autotrophic bacteria becoming chloroplasts.

เพอรอกซิโซม

Figure 7. Peroxisome. Peroxisomes are membrane-bound organelles that contain an abundance of enzymes for detoxifying harmful substances and lipid metabolism.

Like lysosomes, a peroxisome is a membrane-bound cellular organelle that contains mostly enzymes (Figure 7). Peroxisomes perform a couple of different functions, including lipid metabolism and chemical detoxification. In contrast to the digestive enzymes found in lysosomes, the enzymes within peroxisomes serve to transfer hydrogen atoms from various molecules to oxygen, producing hydrogen peroxide (H2โอ2). In this way, peroxisomes neutralize poisons such as alcohol. In order to appreciate the importance of peroxisomes, it is necessary to understand the concept of reactive oxygen species.

Aging and the Cell: The Free Radical Theory

The free radical theory on aging was originally proposed in the 1950s, and still remains under debate. Generally speaking, the free radical theory of aging suggests that accumulated cellular damage from oxidative stress contributes to the physiological and anatomical effects of aging. There are two significantly different versions of this theory: one states that the aging process itself is a result of oxidative damage, and the other states that oxidative damage causes age-related disease and disorders. The latter version of the theory is more widely accepted than the former. However, many lines of evidence suggest that oxidative damage does contribute to the aging process. Research has shown that reducing oxidative damage can result in a longer lifespan in certain organisms such as yeast, worms, and fruit flies. Conversely, increasing oxidative damage can shorten the lifespan of mice and worms. Interestingly, a manipulation called calorie-restriction (moderately restricting the caloric intake) has been shown to increase life span in some laboratory animals. It is believed that this increase is at least in part due to a reduction of oxidative stress. However, a long-term study of primates with calorie-restriction showed no increase in their lifespan. A great deal of additional research will be required to better understand the link between reactive oxygen species and aging.


วัสดุและวิธีการ

We devised a method for prioritizing candidate genes and polymorphisms for chronic pain studies by rating each polymorphism in a candidate gene according to three criteria: (1) strength of evidence supporting involvement of the gene in pain processing, (2) frequency of the specific variant, and (3) likelihood that the polymorphism alters function. We assigned each polymorphism zero to three points in each of these categories, with a maximum score of 9.

1. Involvement in Pain Processing: We searched recent textbook chapters and reviews 15–17and the Society of Neuroscience abstracts from 2000 and 2001 to compile a list of approximately 200 molecules ( appendix 1) that basic scientists have described to be involved in pain processing. We assigned one point for a single laboratory reporting involvement, two points for reports from multiple groups, and three points if there were multiple reports specifically describing involvement in animal models of neuropathic pain, the focus of our human genetic studies. Molecules without reported involvement in pain processing were excluded from our final priority list, even if they had maximum scores for the two other criteria.

2. Frequency: Two authors (I. B., M. B. M.) performed a PubMed search for each of the 200 molecules using the search query [molecule name] AND human AND polymorphism and read pertinent abstracts and articles. We assigned zero points if the population frequency (proportion of all chromosomes) of the variant was less than 3%, one point for 3–10%, two points for 10–30%, and three points for 30–50%.

3. Function: We examined articles resulting from the PubMed search for evidence of functional consequences of polymorphisms of the 200 candidate genes. We assigned one point if the variant changed an amino acid two points for a single report that the variant changed the amount of message or protein expression or function, or was associated with a different clinical outcome from the common allele for a clinical phenotype and three points for independent replication of any of these types of evidence.

Testing Individual Polymorphisms versus Haplotypes

Most published association studies focus on individual polymorphisms, but the current approach of many laboratories is to type many regularly spaced markers on the candidate gene to determine haplotype blocks, which are combinations of common alleles that occur together over 10- to 100-kilobase lengths of DNA. Over each of these DNA segments, approximately 90% of individuals have one of the two to five most common haplotypes. When loci are present in haplotype blocks, their information can be combined and haplotype can be used as genotype. If approximately six loci are tested per block, there is little loss of power to detect the effect of a moderately abundant but unknown functional locus between the tested markers for that block, compared with testing that locus specifically. 18In the discussion that follows, we will usually refer to individual polymorphisms, but the same considerations and methods can be applied using the haplotype block as the unit.

Sample Size

We assume the investigator is studying a cohort of patients exposed to the same injury or disease and genotyping all of the patients, regardless of whether they develop persistent pain. (If patients are plentiful and inexpensive to screen, genotyping only those with clinical outcomes at either extreme of the range may be more statistically informative and cost efficient. 19)


สรุป

The principal cell is arguably the most highly regulated cell type in the kidney tubules, if not in all mammalian epithelia. Because the regulated transport of ions and water is of vital importance to the role that this tubule cell plays in kidney function and homeostasis, we have addressed the basic transport functions of the principal cell primarily from the standpoint of regulation. The central role of two different hormone-transporter pairs was emphasized: aldosterone and ENaC for control of ion transport, and AVP and AQP2 for control of water transport. However, the complex regulation of principal cell function is underscored by the panoply of hormonal, autocrine, paracrine, and physical factors that regulate its activities. A few examples are as follows: ATP, PGE2, and ET, which inhibit both Na + and water transport AngII, which stimulates both Na + and water transport and insulin, which selectively stimulates Na + transport. Under normal physiologic conditions, these diverse regulators exert their effects in various combinations to provide context-appropriate integrated responses to different environmental conditions.

Understanding the signaling and transport mechanisms that underlie principal cell function is valuable to practicing clinicians, both because it enhances our appreciation of the kidney and its role in homeostasis, and because it provides a foundation for greater depth and flexibility in our approach to diagnosis and treatment of the wide array of fluid and electrolyte disorders we encounter.



ความคิดเห็น:

  1. Maccallum

    Bravo, an excellent answer.

  2. Ruffe

    It is remarkable, rather valuable message

  3. Kagalkis

    ฉันคิดว่าคุณไม่ถูกต้อง ฉันสามารถพิสูจน์ได้ เขียนใน PM เราจะพูดคุย

  4. Tolabar

    Not the hardship!

  5. Wulfhere

    This topic only incomparably :), very pleasant.

  6. Nik

    ในความคิดของฉันมีข้อผิดพลาดเกิดขึ้น เขียนถึงฉันใน PM หารือเกี่ยวกับมัน

  7. Yusef

    I thank for the information.



เขียนข้อความ