ข้อมูล

9.6A: ไวรัสที่บกพร่อง - ชีววิทยา

9.6A: ไวรัสที่บกพร่อง - ชีววิทยา


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

วัตถุประสงค์การเรียนรู้

  • แยกแยะระหว่างไวรัสที่บกพร่อง ไวรัสดาวเทียม และไวรัสตัวช่วย

นักไวรัสวิทยายังศึกษาอนุภาคย่อยของไวรัส หน่วยงานที่ติดเชื้อมีขนาดเล็กกว่าและง่ายกว่าไวรัสอย่างเห็นได้ชัด:

  • ไวรอยด์ (โมเลกุล RNA วงกลมเปล่าที่ติดพืช)
  • ดาวเทียม (โมเลกุลกรดนิวคลีอิกที่มีหรือไม่มีแคปซิดที่ต้องการไวรัสตัวช่วยสำหรับการติดเชื้อและการสืบพันธุ์)
  • พรีออน (โปรตีนที่มีอยู่ในรูปแบบทางพยาธิวิทยาที่กระตุ้นให้โมเลกุลพรีออนอื่น ๆ ถือว่ามีโครงสร้างเดียวกัน)

ไวรัสบางชนิดไม่สามารถแพร่พันธุ์ในเซลล์โฮสต์ได้ด้วยตัวเอง เนื่องจากไวรัสมีขนาดเล็ก ขนาดของจีโนมจึงจำกัด ตัวอย่างเช่น ไวรัสบางชนิดมีรหัสคำสั่งสำหรับการสร้างโปรตีนที่แตกต่างกันสองสามชนิดสำหรับ capsid ของไวรัส ในทางกลับกัน รหัสจีโนมของมนุษย์สำหรับโปรตีนต่างๆ มากกว่า 30,000 ชนิด ดังนั้น การขาดรหัสคำสั่งทำให้ไวรัสบางตัวจำเป็นต้องมีไวรัสตัวอื่นเพื่อช่วยให้พวกมันสามารถแพร่พันธุ์ได้เอง ไวรัสดังกล่าวเรียกว่าการจำลองแบบมีข้อบกพร่อง

ดาวเทียมขึ้นอยู่กับการติดเชื้อร่วมของเซลล์โฮสต์กับไวรัสตัวช่วยสำหรับการคูณที่มีประสิทธิผล กรดนิวคลีอิกของพวกมันมีลำดับนิวคลีโอไทด์ที่แตกต่างกันอย่างเป็นสาระสำคัญจากไวรัสตัวช่วยหรือโฮสต์ของพวกมัน เมื่อตัวแทนซับไวรัสจากดาวเทียมเข้ารหัสโปรตีนเคลือบซึ่งมันถูกห่อหุ้มไว้ มันจะเรียกว่าไวรัสดาวเทียม ไม่ควรสับสนอนุภาคไวรัสจากดาวเทียมกับ DNA ดาวเทียม

ไวรัสตับอักเสบเดลต้าของมนุษย์มีจีโนมอาร์เอ็นเอคล้ายกับไวรอยด์ แต่มีชั้นเคลือบโปรตีนที่มาจากไวรัสตับอักเสบบีและไม่สามารถผลิตได้เอง ดังนั้นจึงเป็นไวรัสที่มีข้อบกพร่องและไม่สามารถทำซ้ำได้หากไม่ได้รับความช่วยเหลือจากไวรัสตับอักเสบบี ในทำนองเดียวกัน sputnik virophage ขึ้นอยู่กับ mimivirus ซึ่งแพร่เชื้อ Acanthamoeba castellanii โปรโตซัว ไวรัสเหล่านี้ขึ้นอยู่กับการมีไวรัสสายพันธุ์อื่นในเซลล์เจ้าบ้านเรียกว่าดาวเทียม พวกมันอาจเป็นตัวแทนของตัวกลางวิวัฒนาการของไวรอยด์และไวรัส

ไวรัสตับอักเสบดีหรือที่เรียกว่าไวรัสตับอักเสบดี (HDV) และจัดเป็นไวรัสตับอักเสบเดลต้าเป็นโรคที่เกิดจากไวรัส RNA ที่ห่อหุ้มเป็นวงกลมขนาดเล็ก มันเป็นหนึ่งในห้าไวรัสตับอักเสบที่รู้จักกัน: A, B, C, D และ E HDV ถือเป็นดาวเทียมย่อยเนื่องจากสามารถแพร่กระจายได้เมื่อมีไวรัสตับอักเสบบี (HBV) เท่านั้น การแพร่กระจายของ HDV สามารถเกิดขึ้นได้จากการติดเชื้อ HBV (coinfection) พร้อมกันหรือซ้อนทับกับโรคตับอักเสบบีเรื้อรังหรือสถานะพาหะของไวรัสตับอักเสบบี (superinfection) superinfection และ coinfection กับ HDV ส่งผลให้เกิดภาวะแทรกซ้อนที่รุนแรงกว่าเมื่อเปรียบเทียบกับการติดเชื้อ HBV เพียงอย่างเดียว ภาวะแทรกซ้อนเหล่านี้รวมถึงแนวโน้มที่จะประสบภาวะตับวายในการติดเชื้อเฉียบพลันมากขึ้นและการลุกลามอย่างรวดเร็วไปสู่โรคตับแข็งในตับ โดยมีโอกาสเพิ่มขึ้นที่จะเป็นมะเร็งตับในการติดเชื้อเรื้อรัง เมื่อใช้ร่วมกับไวรัสตับอักเสบบี ไวรัสตับอักเสบดีมีอัตราการเสียชีวิตสูงสุดของการติดเชื้อไวรัสตับอักเสบทั้งหมด 20%

ประเด็นสำคัญ

  • ไวรัสบางชนิดไม่สามารถแพร่พันธุ์ในเซลล์โฮสต์ได้ด้วยตัวเอง การขาดรหัสคำสั่งทำให้ไวรัสบางตัวจำเป็นต้องมีไวรัสตัวอื่นเพื่อช่วยให้พวกมันสามารถแพร่พันธุ์ได้เอง ไวรัสดังกล่าวเรียกว่าการจำลองแบบมีข้อบกพร่อง
  • ดาวเทียมเป็นตัวแทนย่อยของไวรัสที่ประกอบด้วยกรดนิวคลีอิกที่ขึ้นอยู่กับการติดเชื้อร่วมของเซลล์เจ้าบ้านกับผู้ช่วยหรือไวรัสหลักสำหรับการคูณ เมื่อดาวเทียมเข้ารหัสโปรตีนเคลือบซึ่งกรดนิวคลีอิกถูกห่อหุ้มไว้ จะเรียกว่าไวรัสดาวเทียม
  • ไวรัสเหล่านี้ขึ้นอยู่กับการมีอยู่ของไวรัสสายพันธุ์อื่นในเซลล์โฮสต์เรียกว่าดาวเทียมและอาจเป็นตัวแทนของตัวกลางวิวัฒนาการของไวรอยด์และไวรัส

คำสำคัญ

  • ไวรัสตัวช่วย: ไวรัสตัวช่วยคือไวรัสที่ใช้ในการผลิตสำเนาของไวรัสเวคเตอร์ที่พึ่งพาตัวช่วยซึ่งไม่มีความสามารถในการทำซ้ำได้เอง ไวรัสตัวช่วยถูกใช้เพื่อทำให้เซลล์เกิดการติดเชื้อควบคู่ไปกับไวรัสเวคเตอร์และให้เอ็นไซม์ที่จำเป็นสำหรับการจำลองจีโนมของพาหะของไวรัส
  • ดาวเทียม: ตัวแทนย่อยไวรัสประกอบด้วยกรดนิวคลีอิกที่ขึ้นอยู่กับการติดเชื้อร่วมของเซลล์เจ้าบ้านกับผู้ช่วยหรือไวรัสหลักสำหรับการคูณ

การแพร่กระจายของไวรัสแบบรวมเป็นสื่อกลางโดย Virion Aggregates ส่งเสริมวิวัฒนาการของอนุภาครบกวนที่มีข้อบกพร่อง

รายงานการศึกษาจำนวนมากขึ้นเรื่อยๆ ว่าไวรัสสามารถแพร่กระจายเป็นกลุ่มในหน่วยติดเชื้อที่เรียกว่าส่วนรวม โดยการเพิ่มความหลากหลายของเซลล์ของการติดเชื้อ การแพร่กระจายโดยรวมอาจอนุญาตให้มีปฏิสัมพันธ์เหมือนสังคม เช่น ความร่วมมือหรือการโกง ยังไม่ค่อยมีใครรู้เกี่ยวกับวิวัฒนาการของการโต้ตอบดังกล่าว ในงานก่อนหน้านี้กับไวรัสปากเปื่อย เราแสดงให้เห็นว่าการรวมตัวของ virion ช่วยเร่งระยะการติดเชื้อในระยะเริ่มต้นในเซลล์ส่วนใหญ่ โดยให้ประโยชน์ด้านสมรรถภาพร่างกายในระยะสั้นต่อไวรัส ที่นี่ เราตรวจสอบผลกระทบของการรวมตัวของ virion ในรอบการติดเชื้อหลายรอบ โฟลว์ไซโตเมทรี, การหาลำดับเชิงลึก, การทดสอบการติดเชื้อ, PCR เชิงปริมาณการถอดรหัสย้อนกลับ และกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนเปิดเผยว่าการรวมตัวของ virion ส่งเสริมการเกิดขึ้นของอนุภาครบกวนที่มีข้อบกพร่องอย่างรวดเร็ว ดังนั้น การรวมตัวของ virion ให้ประโยชน์ด้านการออกกำลังกายแก่ไวรัสในทันที แต่จะมีค่าใช้จ่ายด้านฟิตเนสหลังจากเกิดไวรัสไม่กี่รุ่น นี่แสดงให้เห็นว่ากลยุทธ์ที่เหมาะสมที่สุดสำหรับไวรัสคือต้องผ่านการรวมตัวของ virion แบบเป็นตอนๆ เท่านั้น เช่น ในระหว่างการแพร่เชื้อระหว่างโฮสต์ความสำคัญ ข้อมูลเชิงลึกล่าสุดเปิดเผยว่าไวรัสใช้กลยุทธ์ที่หลากหลายในการปล่อยจีโนมของไวรัสหลายตัวในเซลล์เป้าหมายเดียวกัน ทำให้เกิดปฏิสัมพันธ์ที่เป็นประโยชน์ แต่ยังเป็นอันตรายระหว่างไวรัสภายในเซลล์ที่ติดเชื้อ สิ่งนี้กระตุ้นความสนใจในหมู่นักนิเวศวิทยาจุลินทรีย์และนักชีววิทยาเชิงวิวัฒนาการในการศึกษาว่าการแพร่กระจายโดยรวมส่งผลกระทบต่อผลลัพธ์ของการติดเชื้อไวรัสอย่างไร ในที่นี้ เราใช้ไวรัสปากเปื่อยเป็นระบบต้นแบบในการศึกษาผลกระทบเชิงวิวัฒนาการของการแพร่กระจายแบบกลุ่มโดยอาศัยการรวมตัวของไวรัส เนื่องจากไวรัสนี้สามารถรวมตัวได้เองในที่ที่มีน้ำลาย เราพบว่าการรวมกลุ่มที่ขับเคลื่อนด้วยน้ำลายมีผลสองประการต่อสมรรถภาพของไวรัส ในขณะที่การรวมกลุ่มมีแนวโน้มที่จะเพิ่มการติดเชื้อในระยะสั้น มวลรวมของ virion มีความอ่อนไหวสูงต่อการบุกรุกโดยตัวแปรที่มีข้อบกพร่องที่ไม่ให้ความร่วมมือหลังจากเกิดไวรัสไม่กี่รุ่น

คำสำคัญ: หน่วยติดเชื้อรวม อนุภาครบกวนที่มีข้อบกพร่อง วิวัฒนาการการทดลอง วิวัฒนาการทางสังคม ไวรัสปากเปื่อย

ลิขสิทธิ์ © 2020 Andreu-Moreno และ Sanjuán.

ตัวเลข

วิวัฒนาการของอัตราการเกิดการติดเชื้อจากน้ำลาย…

วิวัฒนาการของอัตราการติดเชื้อที่เกิดจากน้ำลาย (A) ไวรัสผู้ก่อตั้ง ไมโครกราฟเรืองแสงของจุดโฟกัสของการติดเชื้อ…

VSV การจัดลำดับเชิงลึก (A) ไม่ตรงกัน…

VSV การจัดลำดับเชิงลึก (A) ความถี่การกลายพันธุ์ที่ไม่ตรงกันตามจีโนมของไวรัส ความถี่การกลายพันธุ์…

การรวม Virion ส่งเสริมการเกิดขึ้น ...

การรวม Virion ส่งเสริมการเกิดขึ้นของ DIP (A) การทดสอบการลดผลผลิต ไทเท…


เชิงนามธรรม

การติดเชื้อไวรัส Influenza A (IAV) อาจรุนแรงหรือถึงขั้นเสียชีวิตในเด็กเล็ก ผู้สูงอายุ และผู้ป่วยที่มีอาการป่วยบางอย่าง การติดเชื้อของบุคคลที่มีสุขภาพดีอย่างเห็นได้ชัดยังคงมีสาเหตุจากโรคร้ายแรงและการเสียชีวิตจำนวนมาก ซึ่งบ่งชี้ว่าไวรัสที่มีการก่อโรคเพิ่มขึ้นจะแพร่กระจายร่วมกับไวรัสที่แพร่ระบาดหรือไวรัสระบาด เมื่อมองหาปัจจัยที่อาจก่อให้เกิดความรุนแรง เราได้ระบุการกลายพันธุ์ของโพลีเมอเรส PA D529N ที่ตรวจพบในคดี IAV ที่ร้ายแรง ซึ่งมีการแนะนำกระดูกสันหลังของไวรัสลูกผสมสองชนิดที่แตกต่างกัน ส่งผลให้การผลิตจีโนมของไวรัสบกพร่อง (DVG) ลดลง การกลายพันธุ์นี้ทำให้เกิดการเหนี่ยวนำการตอบสนองต่อไวรัสในระดับต่ำในเซลล์ที่ติดเชื้อและเพิ่มการเกิดโรคในหนู เพื่อวิเคราะห์ความสัมพันธ์ระหว่างการผลิต DVGs ต่ำและการเกิดโรคในมนุษย์ เราได้ทำการวิเคราะห์จีโนมของไวรัสที่แยกได้จากกลุ่มคนที่มีสุขภาพดีก่อนหน้านี้ซึ่งประสบกับการติดเชื้อ IAV ที่รุนแรงมากซึ่งต้องเข้ารับการรักษาใน Intensive Care Unit และผู้ป่วยที่มีผลร้ายแรงซึ่งแสดงอาการทางการแพทย์เพิ่มเติม เงื่อนไข. ไวรัสเหล่านี้ถูกนำมาเปรียบเทียบกับไวรัสที่แยกได้จากกลุ่มผู้ป่วย IAV ที่ไม่รุนแรง พบไวรัสที่มีการสะสม DVG น้อยกว่าในผู้ป่วยที่มีผลลัพธ์ที่รุนแรง/ถึงแก่ชีวิตมากกว่าในโรคที่ไม่รุนแรง ซึ่งบ่งชี้ว่าการมี DVG ที่ต่ำทำให้เกิดตัวบ่งชี้การก่อโรคในมนุษย์


เชิงนามธรรม

ไวรัสเป็นสารประกอบเชิงซ้อนของซูปราโมเลคิวลาร์ที่มีลำดับสูงซึ่งมีวิวัฒนาการเพื่อแพร่กระจายระหว่างสิ่งมีชีวิตที่เกี่ยวข้อง แม้ว่าไวรัสจะมีความหลากหลายมาก แต่ก็มีหน้าที่และคุณสมบัติร่วมกัน ในการทบทวนนี้ เรามุ่งหวังที่จะให้ภาพรวมของการประกอบตัวเองของไวรัสและกลไกของอนุภาคไวรัส โดยสรุปความสำเร็จทางวิทยาศาสตร์ล่าสุดภายในพื้นที่เหล่านี้


9.6A: ไวรัสที่บกพร่อง - ชีววิทยา

บทความทั้งหมดที่เผยแพร่โดย MDPI เผยแพร่ทันทีทั่วโลกภายใต้ใบอนุญาตการเข้าถึงแบบเปิด ไม่จำเป็นต้องได้รับอนุญาตพิเศษเพื่อนำบทความทั้งหมดหรือบางส่วนที่เผยแพร่โดย MDPI กลับมาใช้ใหม่ รวมถึงตัวเลขและตาราง สำหรับบทความที่ตีพิมพ์ภายใต้ใบอนุญาต Creative Common CC BY แบบเปิด ส่วนหนึ่งส่วนใดของบทความอาจถูกนำกลับมาใช้ใหม่โดยไม่ได้รับอนุญาตโดยมีเงื่อนไขว่าบทความต้นฉบับมีการอ้างอิงอย่างชัดเจน

เอกสารคุณลักษณะแสดงถึงการวิจัยขั้นสูงสุดที่มีศักยภาพสำคัญสำหรับผลกระทบสูงในภาคสนาม เอกสารคุณลักษณะจะถูกส่งเมื่อได้รับคำเชิญหรือคำแนะนำเป็นรายบุคคลโดยบรรณาธิการทางวิทยาศาสตร์และได้รับการทบทวนโดยเพื่อนก่อนที่จะตีพิมพ์

เอกสารคุณลักษณะสามารถเป็นได้ทั้งบทความวิจัยต้นฉบับ การศึกษาวิจัยนวนิยายจำนวนมากที่มักเกี่ยวข้องกับเทคนิคหรือแนวทางต่างๆ หรือรายงานการทบทวนที่ครอบคลุมพร้อมข้อมูลอัปเดตที่กระชับและแม่นยำเกี่ยวกับความก้าวหน้าล่าสุดในสาขาที่ทบทวนความก้าวหน้าทางวิทยาศาสตร์ที่น่าตื่นเต้นที่สุดอย่างเป็นระบบ วรรณกรรม. กระดาษประเภทนี้ให้มุมมองเกี่ยวกับทิศทางการวิจัยในอนาคตหรือการใช้งานที่เป็นไปได้

บทความ Editor's Choice อิงตามคำแนะนำของบรรณาธิการทางวิทยาศาสตร์ของวารสาร MDPI จากทั่วโลก บรรณาธิการเลือกบทความจำนวนเล็กน้อยที่ตีพิมพ์เมื่อเร็วๆ นี้ในวารสารที่พวกเขาเชื่อว่าน่าสนใจเป็นพิเศษสำหรับผู้เขียน หรือมีความสำคัญในสาขานี้ จุดมุ่งหมายคือการจัดทำภาพรวมของงานที่น่าตื่นเต้นที่สุดบางส่วนที่เผยแพร่ในพื้นที่การวิจัยต่างๆของวารสาร


สารบัญ

DIP เป็นปรากฏการณ์ที่เกิดขึ้นตามธรรมชาติซึ่งสามารถสร้างขึ้นใหม่ได้ภายใต้สภาวะการทดลองในห้องปฏิบัติการ และยังสามารถสังเคราะห์ขึ้นเพื่อใช้ในการทดลองได้อีกด้วย พวกมันถูกสร้างขึ้นเองโดยธรรมชาติโดยการจำลองแบบของไวรัสที่มีแนวโน้มผิดพลาด บางสิ่งที่แพร่หลายโดยเฉพาะอย่างยิ่งในไวรัส RNA เหนือไวรัส DNA เนื่องจากเอนไซม์ที่ใช้ (การจำลองแบบหรือ RNA-dependent RNA polymerase) [6] [19] DI จีโนมมักจะเก็บลำดับปลายทางที่จำเป็น สำหรับการรับรู้โดยไวรัสโพลีเมอเรส และลำดับการบรรจุจีโนมของพวกมันให้กลายเป็นอนุภาคใหม่ [20] [21] ขนาดของเหตุการณ์การลบจีโนมอาจแตกต่างกันมาก โดยตัวอย่างหนึ่งใน DIP ที่ได้มาจากไวรัสพิษสุนัขบ้าแสดงการลบ 6.1 kb [22] ในอีกตัวอย่างหนึ่ง ขนาดของจีโนมไวรัสพืช DI-DNA หลายจีโนมแปรผันจากหนึ่งในสิบของขนาดของจีโนมดั้งเดิมถึงครึ่งหนึ่ง [23]

อนุภาคเหล่านี้ถือเป็นการรบกวนเมื่อส่งผลต่อการทำงานของไวรัสแม่ผ่านการยับยั้งการแข่งขัน [6] ระหว่างการติดเชื้อ กล่าวอีกนัยหนึ่ง ไวรัสที่มีข้อบกพร่องและไม่มีข้อบกพร่องจะทำซ้ำพร้อมกัน แต่เมื่ออนุภาคที่มีข้อบกพร่องเพิ่มขึ้น ปริมาณของไวรัสที่ไม่มีข้อบกพร่องที่จำลองแบบจะลดลง ขอบเขตของการรบกวนขึ้นอยู่กับชนิดและขนาดของการเบี่ยงเบนในจีโนม การลบข้อมูลจีโนมจำนวนมากทำให้สามารถจำลองจีโนมที่บกพร่องได้อย่างรวดเร็ว [20] ระหว่างการติดเชื้อในเซลล์เจ้าบ้าน ในที่สุดอัตราส่วนวิกฤตจะถึงซึ่งปัจจัยไวรัสถูกใช้เพื่อผลิต DIP ที่ไม่ติดเชื้อมากกว่าอนุภาคที่ติดเชื้อ [20] อนุภาคที่บกพร่องและจีโนมที่บกพร่องยังแสดงให้เห็นเพื่อกระตุ้นการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันโดยกำเนิดของโฮสต์ และการปรากฏตัวของพวกมันในระหว่างการติดเชื้อไวรัสมีความสัมพันธ์กับความแรงของการตอบสนองต่อไวรัส (11)

ลักษณะการรบกวนนี้มีความสำคัญมากขึ้นเรื่อยๆ สำหรับการวิจัยเกี่ยวกับการบำบัดไวรัส [24] คิดว่าเนื่องจากความจำเพาะ DIPs จะถูกกำหนดเป้าหมายไปยังไซต์ที่ติดเชื้อ ในตัวอย่างนี้ นักวิทยาศาสตร์ได้ใช้ DIP เพื่อสร้าง "การป้องกันไวรัส" ซึ่งทำให้การก่อโรคของการติดเชื้อไข้หวัดใหญ่ A ในหนูลดลงจนไม่เป็นอันตรายถึงชีวิตอีกต่อไป [25]

กรมทรัพย์สินทางปัญญาแสดงให้เห็นว่ามีบทบาทในการเกิดโรคของไวรัสบางชนิด งานวิจัยชิ้นหนึ่งแสดงให้เห็นถึงความสัมพันธ์ระหว่างเชื้อโรคกับตัวแปรที่มีข้อบกพร่อง แสดงให้เห็นว่ากฎระเบียบของการผลิต DI ช่วยให้ไวรัสลดการจำลองการติดเชื้อของตัวเอง ลดปริมาณไวรัสและเพิ่มประสิทธิภาพของปรสิตด้วยการป้องกันไม่ให้โฮสต์ตายเร็วเกินไป [26] สิ่งนี้ยังช่วยให้ไวรัสมีเวลามากขึ้นในการแพร่กระจายและแพร่เชื้อไปยังโฮสต์ใหม่ การสร้าง DIP ได้รับการควบคุมภายในไวรัส: องค์ประกอบการจำลองแบบ cis ที่ออกฤทธิ์ของ Coronavirus SL-III (แสดงในรูปภาพ) เป็นโครงสร้างจีโนมระดับสูงที่เกี่ยวข้องกับการไกล่เกลี่ยการผลิต DIP ในโคโรนาไวรัสโคโรนา โดยตรวจพบโฮโมล็อกที่ชัดเจนในกลุ่มโคโรนาไวรัสอื่นๆ [1] มีการแนะนำเชิงลึกมากขึ้นในผลงานของ Alice Huang และ David Baltimore จากปี 1970 [27]

  1. การละทิ้งการลบคือเมื่อมีการข้ามส่วนย่อยของเทมเพลต ตัวอย่างของการละทิ้งประเภทนี้สามารถพบได้ในไวรัสโรคเหี่ยวมะเขือเทศและไวรัส Flock House [28][29]
  2. การละเว้น Snapbacks เกิดขึ้นเมื่อการจำลองแบบถอดความส่วนหนึ่งของสาระหนึ่งแล้วใช้สาระใหม่นี้เป็นแม่แบบ ผลที่ได้นี้สามารถสร้างกิ๊บติดผมได้ มีการตรวจพบการเบี่ยงเบนของ Snapback ในไวรัสปากเปื่อย [30]
  3. ข้อบกพร่องขอทานคือเมื่อพอลิเมอเรสนำเส้นใยที่ทำขึ้นบางส่วนแล้วสลับกลับไปเพื่อถอดความปลาย 5' สร้างรูปร่างขอทาน การขอทานจะพบได้ในไวรัสไข้หวัดใหญ่ [31]
  4. การละทิ้งแบบผสมเกิดขึ้นเมื่อทั้งการลบและการละเลยสแนปแบ็คเกิดขึ้นพร้อมกัน
  5. โมเสกหรือจีโนม DI ที่ซับซ้อน ซึ่งบริเวณต่างๆ อาจมาจากจีโนมไวรัสตัวช่วยเดียวกัน แต่อยู่ในลำดับที่ไม่ถูกต้องจากเซ็กเมนต์จีโนมของผู้ช่วยเหลือที่แตกต่างกัน หรืออาจรวมถึงส่วนของโฮสต์ RNA การซ้ำซ้อนอาจเกิดขึ้น [3]

การวิจัยได้ดำเนินการโดยนักไวรัสวิทยาเพื่อเรียนรู้เพิ่มเติมเกี่ยวกับการแทรกแซงในการติดเชื้อของเซลล์เจ้าบ้านและวิธีที่จีโนม DI อาจทำงานเป็นยาต้านไวรัสได้ [3] บทความปี 2014 อธิบายงานพรีคลินิกเพื่อทดสอบประสิทธิภาพในการต่อต้านไวรัสไข้หวัดใหญ่ [32] นอกจากนี้ยังพบว่า DI-RNAs ช่วยในการติดเชื้อราผ่านไวรัสของครอบครัว Partitiviridae เป็นครั้งแรกซึ่งทำให้มีที่ว่างสำหรับการทำงานแบบสหวิทยาการมากขึ้น (19)

เครื่องมือหลายอย่างเช่น ViReMa [33] และ DI-tector [34] ได้รับการพัฒนาเพื่อช่วยในการตรวจจับจีโนมของไวรัสที่มีข้อบกพร่องในข้อมูลการจัดลำดับยุคหน้า


พื้นหลัง

มะเร็งกลายเป็นสาเหตุการเสียชีวิตอันดับต้นๆ ของโลก ทุกปีมีการวินิจฉัยโรคมะเร็งชนิดใหม่ 18 ล้านครั้ง ทำให้มีผู้เสียชีวิตเกือบ 10 ล้านคน (International Agency for Research on Cancer (IARC), 2019) มีความก้าวหน้าอย่างมีนัยสำคัญในการป้องกันและวินิจฉัยโรคมะเร็ง แต่อุบัติการณ์และการตายยังคงเพิ่มขึ้น [1,2,3] การรักษาแบบทั่วไป เช่น การผ่าตัด เคมีบำบัด การรักษาด้วยฮอร์โมน การรักษาแบบกำหนดเป้าหมาย หรือการฉายรังสี ให้การตอบสนองที่คงทนอย่างจำกัดในผู้ป่วยส่วนใหญ่ที่เป็นมะเร็งระยะลุกลาม [4, 5] มะเร็งทางโลหิตวิทยาและอัณฑะเป็นข้อยกเว้นบางประการที่การรักษาในปัจจุบันสามารถรักษาให้หายขาดได้แม้ในกรณีที่เป็นมะเร็งระยะลุกลาม [6,7,8]

มะเร็งเป็นโรคทางพันธุกรรมและแสดงถึงอาการต่างๆ หลักการของการสร้างเนื้องอกมีความคล้ายคลึงกันในเนื้องอกต่างๆ และมีลักษณะเฉพาะที่ค่อนข้างดี โดยสังเขป การกลายพันธุ์บ่อยครั้งเกิดขึ้นระหว่างการแบ่งเซลล์หรือเนื่องจากปัจจัยภายนอก เช่น การฉายรังสีหรือสารก่อมะเร็งอื่นๆ การกลายพันธุ์เหล่านี้ส่วนใหญ่ได้รับการแก้ไขโดยโปรตีนภายในเซลล์เฉพาะ หากกลไกดังกล่าวไม่ประสบความสำเร็จ โดยทั่วไปเซลล์ที่กลายพันธุ์จะถูกกำจัดโดยอะพอพโทซิส การกลายพันธุ์ส่วนใหญ่ไม่ได้ช่วยให้เซลล์ได้รับคุณสมบัติของมะเร็ง (การกลายพันธุ์ของผู้โดยสาร) ในทางตรงกันข้าม การกลายพันธุ์ของไดรเวอร์ให้ความสามารถพิเศษเฉพาะกับเซลล์เนื้องอก เช่น การต้านทานการตายของเซลล์หรือความสามารถในการแพร่กระจาย ตัวอย่างเช่น [9, 10] อย่างไรก็ตาม เซลล์ที่กลายพันธุ์เหล่านี้ส่วนใหญ่ได้รับการยอมรับจากระบบภูมิคุ้มกันของเราและถูกทำลายก่อนที่จะตรวจพบทางคลินิก หลักฐานที่สะสมมาสนับสนุนแนวคิดที่ว่าระบบภูมิคุ้มกันที่บกพร่องนั้นสัมพันธ์อย่างใกล้ชิดกับการพัฒนาของเนื้องอก การลุกลาม และการกลับเป็นซ้ำ [11] ยังเป็นที่รู้จักกันในนามการกดภูมิคุ้มกัน ปรากฏการณ์นี้แพร่กระจายอย่างแข็งขันโดยเซลล์มะเร็งโดยตรงหรือผ่านสภาพแวดล้อมจุลภาคของเนื้องอก [12] ความเข้าใจนี้ได้กระตุ้นความสนใจในการพัฒนาภูมิคุ้มกันบำบัด ซึ่งมีจุดมุ่งหมายเพื่อปรับเปลี่ยนและกระตุ้นเซลล์ภูมิคุ้มกันเพื่อโจมตีเซลล์มะเร็ง แนวทางนี้มีเหตุผลเนื่องจากระบบภูมิคุ้มกันของเราได้รับการฝึกฝนให้ตรวจจับ ทำลาย และจดจำรูปแบบที่ไม่ใช่ตัวตน ตามคำนิยาม เซลล์มะเร็งทั้งหมดมีการกลายพันธุ์หลายครั้งทำให้เกิดโครงสร้างที่ไม่ใช่ตัวเอง ซึ่งระบบภูมิคุ้มกันของเราอาจถูกตรวจพบได้ [9]

แนวคิดของการบำบัดด้วยภูมิคุ้มกันได้รับการยอมรับมานานหลายศตวรรษแล้ว (ตารางที่ 1) มีรายงานความสัมพันธ์ระหว่างการติดเชื้อจุลินทรีย์กับการถดถอยของเนื้องอกที่เกิดขึ้นเองหลายครั้งในเอกสาร [13] หลักฐานแรกน่าจะเป็น Ebers papyrus (1550 BC) ซึ่งเป็นหนึ่งในเอกสารทางการแพทย์ที่เก่าแก่และสำคัญที่สุดของอียิปต์โบราณ แพทย์ของฟาโรห์อิมโฮเทปแห่งอียิปต์ (2600 ปีก่อนคริสตกาล) ใช้ยาพอกตามด้วยการกรีดเพื่อรักษาเนื้องอก สิ่งนี้อำนวยความสะดวกในการพัฒนาของการติดเชื้อซึ่งช่วยทำให้เกิดการถดถอยของเนื้องอก [14] ในปี ค.ศ. 1320 Peregrine Laziozi ได้รับผลกระทบจากมะเร็งของกระดูกหน้าแข้งที่ต้องตัดแขนขา น่าเสียดายที่มีการสังเกตการกลับเป็นซ้ำและความก้าวหน้าในท้องถิ่นและในที่สุดเนื้องอกก็เติบโตผ่านผิวหนังของเขาทำให้เกิดการติดเชื้อ ต่อมา ทำให้ทุกคนประหลาดใจ เนื้องอกหายไปและไม่พบอาการกำเริบอีก ปรากฏการณ์นี้เป็นที่รู้จักกันในปัจจุบันในชื่อเนื้องอก St. Peregrine [15]

ในศตวรรษที่สิบเจ็ดและสิบแปด รูปแบบต่างๆ ของการบำบัดด้วยภูมิคุ้มกันได้ถูกนำมาใช้กันอย่างแพร่หลาย ในศตวรรษที่สิบแปดและสิบเก้า บางครั้งใช้น้ำสลัดเกรอะปิดแผลที่เนื้องอกเป็นแผล แผลผ่าตัดอาจจงใจเปิดทิ้งไว้เพื่อให้เกิดการติดเชื้อได้ เนื่องจากการติดเชื้อที่เป็นหนองนั้นมีประโยชน์ [15] ศัลยแพทย์วิลเลียม บี. โคลีย์รายงานชุดกรณีที่มีรายละเอียดมากขึ้นชุดหนึ่ง ซึ่งระบุคำตอบหลายข้อ เขารักษาผู้ป่วยโรคมะเร็งด้วยแบคทีเรียไลเสต (Streptococcus pyogenes ที่ฆ่าด้วยความร้อนและ Serratia marcescens) หรือที่เรียกว่าสารพิษของ Coley [16]

รายงานของไวรัสที่มีประโยชน์ในการรักษาโรคมะเร็งเริ่มปรากฏขึ้นเมื่อต้นศตวรรษที่ผ่านมา โดยมีรายงานผู้ป่วยมะเร็งเม็ดเลือดขาวหลายรายที่ปลอดจากโรคหลังจากติดเชื้อไวรัส [17] โดยทั่วไป ผู้ป่วยที่รายงานยังอายุน้อย และการหายจากโรคนั้นมีอายุสั้นเป็นเวลา 1 หรือ 2 เดือน [18] การสังเกตเหล่านี้ไม่ได้ถูกมองข้ามโดยชุมชนทางการแพทย์ ซึ่งต่อมาเริ่มใช้ไวรัสเพื่อรักษามะเร็ง โดยเฉพาะอย่างยิ่งในช่วงทศวรรษ 1950 และ 1960 ไวรัสชนิดพันธุ์ป่าหลายชนิด (เช่น ตับอักเสบ Epstein-Barr เวสต์ไนล์ ยูกันดา ไข้เลือดออก สีเหลืองน้อยกว่า) ถูกใช้เพื่อรักษามะเร็งชนิดต่างๆ ในหลายกรณี ผลลัพธ์มีความผันแปรและบางครั้งก็มีการบันทึกที่ไม่ดี [17] อย่างไรก็ตาม ในช่วงเวลานี้ เป็นที่ชัดเจนว่าไวรัสชนิดพันธุ์ป่าส่วนใหญ่ขาดประสิทธิภาพหรือความปลอดภัย ผลลัพธ์ที่มีแนวโน้มดีขึ้นบางส่วนที่มีผลข้างเคียงที่ยอมรับได้นั้นสัมพันธ์กับไวรัส adenoidal-pharyngeal-conjunctival [19,20,21,22] ซึ่งปัจจุบันรู้จักกันในชื่อ adenovirus ตัวอย่างเช่น ในปี 1956 ผู้หญิง 30 คนที่เป็นมะเร็งปากมดลูกระยะลุกลามได้รับการรักษาด้วย adenovirus ใช้การบริหารภายในหลอดเลือดแดงทางหลอดเลือดดำและภายในเนื้องอก ภายใน 10 วัน ผู้ป่วย 2 ใน 3 พบเนื้อร้ายในเนื้องอก และที่สังเกตได้ชัดเจนที่สุด ดูเหมือนว่าจะจำกัดอยู่ที่เนื้อเยื่อมะเร็ง ไม่มีรายงานปัญหาด้านความปลอดภัยในการใช้ไวรัสชนิดพันธุ์ป่านี้ ซึ่งบ่งบอกถึงระดับของการเกิดเนื้องอกตามธรรมชาติ

อย่างไรก็ตาม โดยทั่วไปแล้ว การบำบัดด้วยไวรัสได้รับความสนใจเพียงเล็กน้อย และในปี 1970 และ 1980 ด้านกฎระเบียบของการทดลองทางคลินิกกับเชื้อโรคที่มีชีวิตก็เข้มงวดขึ้น ในทางกลับกัน การบำบัดด้วยเคมีบำบัด การฉายรังสี การรักษาด้วยฮอร์โมน การบำบัดแบบเจาะจงเป้าหมาย และการบำบัดต้านหลอดเลือดกลายเป็นกระแสหลัก ต้องใช้เวลามากกว่าสามทศวรรษกว่าไวรัสจะกลับมาปรากฏอีกครั้ง คราวนี้เป็น “ไวรัสที่ก่อให้เกิดมะเร็ง” [23, 24] ไวรัส oncolytic เป็นไวรัสที่ติดเชื้อและสลาย (สลาย) เซลล์มะเร็ง แต่ไม่ใช่เซลล์ปกติ ไวรัส Oncolytic สามารถเกิดขึ้นได้ตามธรรมชาติหรือสร้างขึ้นในห้องปฏิบัติการโดยการปรับเปลี่ยนไวรัสตามธรรมชาติ การปรับเปลี่ยนเหล่านี้ได้เริ่มต้นยุคใหม่ของการบำบัดด้วยไวรัสที่มีเป้าหมายเป็นมะเร็งที่เป็นพิษน้อยกว่า [25]

การเพิ่มขึ้นอย่างรวดเร็วของเทคนิคทางเทคโนโลยีชีวภาพระดับโมเลกุลหมายถึงการพัฒนากลยุทธ์ใหม่ๆ เพื่อควบคุมระบบภูมิคุ้มกันสำหรับการรักษามะเร็ง ในปัจจุบัน แนวทางต่างๆ มากมาย รวมถึงการรักษาเซลล์แบบรับเลี้ยงบุตรบุญธรรม โมโนโคลนอลแอนติบอดี สารยับยั้งจุดตรวจ และไวรัสมะเร็งผิวหนัง เป็นความก้าวหน้าที่โดดเด่นที่สุดในการรักษามะเร็งเนื่องจากความสามารถในการให้การตอบสนองทางคลินิกที่คงทนและมีประสิทธิภาพในผู้ป่วยมะเร็ง [13] การรักษาแบบทั่วไป เช่น การฉายรังสีและเคมีบำบัด ดูเหมือนว่าจะมีผลกระตุ้นภูมิคุ้มกันที่ไม่เป็นที่รู้จักมาก่อน [26, 27]

อย่างไรก็ตาม สิ่งสำคัญคือต้องสังเกตว่าผลประโยชน์ในการรักษาในปัจจุบันจำกัดเฉพาะผู้ป่วยที่ได้รับการรักษาด้วยภูมิคุ้มกันบำบัดเพียงบางส่วนเท่านั้น โดยเฉพาะอย่างยิ่ง มะเร็งที่เป็นก้อนโดยทั่วไปมีสภาพแวดล้อมจุลภาคของเนื้องอกที่กดขี่ซึ่งยับยั้งการทำงานของทีเซลล์และสนับสนุนการลุกลามของเนื้องอก [28] นอกจากนี้ การรักษาด้วยภูมิคุ้มกันบำบัดแบบใหม่ยังทำให้เกิดเหตุการณ์ไม่พึงประสงค์ทางภูมิคุ้มกันใหม่ๆ ซึ่งรวมถึงพายุไซโตไคน์และเหตุการณ์ภูมิต้านตนเอง เมื่อพิจารณาถึงความท้าทายเหล่านี้ จำเป็นต้องมีการปรับเปลี่ยนกลยุทธ์การรักษาเพิ่มเติม นอกจากกลยุทธ์การรักษาทางภูมิคุ้มกันแบบใหม่แล้ว เรายังต้องการความเข้าใจที่ดีขึ้นเกี่ยวกับสภาพแวดล้อมภูมิคุ้มกันของแต่ละบุคคล เพื่อให้เกิดประโยชน์สูงสุดแก่ผู้ป่วย

เป้าหมายของเราในการตรวจสอบนี้คือการนำเสนอความเป็นไปได้ในปัจจุบันที่ไวรัส oncolytic นำเสนอ เรามุ่งเน้นที่ adenoviruses ซึ่งเป็นไวรัสที่มีการศึกษาอย่างกว้างขวางที่สุด เราเริ่มต้นด้วยการอธิบายชีววิทยา adenovirus ทั่วไปและอธิบายการดัดแปลงทั่วไปบางอย่างที่สามารถใช้เพื่อสร้างความสามารถในการต่อต้านมะเร็งได้ดีขึ้น สุดท้าย เราอธิบายการศึกษาทางคลินิกด้วย oncolytic adenoviruses และอธิบายไวรัส oncolytic ที่แตกต่างกันสามประเภทที่ได้รับการอนุมัติด้านกฎระเบียบสำหรับการรักษามะเร็งแล้ว จุดมุ่งหมายคือการให้ภาพรวมทั่วไปเกี่ยวกับภาคสนาม และเรารับทราบว่าโครงสร้างไวรัสจำนวนมาก โดยเฉพาะอย่างยิ่งกับการศึกษาพรีคลินิกเท่านั้น จะไม่ครอบคลุม อย่างไรก็ตาม การสรรหาหรือเสร็จสิ้นการทดลอง oncolytic adenovirus (ที่มา Clinictrials.org) ให้มุมมองทั่วไปที่ดีว่าปัจจุบันนี้อยู่ที่ใด สุดท้ายนี้ เราสรุปโดยพูดถึงมุมมองในอนาคตบางส่วน


วัสดุและวิธีการ

เส้นเซลล์

เซลล์เอ็มบริโอของมนุษย์ (HEK) 293 เซลล์, เซลล์ออสทีโอซาร์โคมาของมนุษย์ U2OS และ A549 มนุษย์ มะเร็งต่อมลูกหมาก เซลล์เยื่อบุผิวที่เป็นฐานของถุงลม ปลูกใน Modified Eagle Medium ของ Dulbecco (DMEM, Gibco, Thermo Fisher) เสริมด้วย 10% Fetal Bovine serum (FBS) สายเซลล์ไกลโอบลาสโตมาของมนุษย์ U87-MG [85] และ เซลล์บุผนังหลอดเลือดในสายสะดือของมนุษย์ (HUVEC) ปลูกในขั้นต่ำ Essential Medium (MEM) alpha (Gibco, Thermo Fisher) และ Endothelial Growth Medium (EGM, Lonza) -2% FBS เสริมด้วยส่วนประกอบ EGM Bullet Kit (Lonza) เซลล์ U2OS-Cas9 [86] ถูกปลูกใน DMEM-10%FBS-10 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร blasticidin เซลล์ HEK293T.219 ที่มีจีโนม KSHV ถูกสร้างขึ้นโดยการส่งผ่าน rKSHV.219 ที่ปราศจากเซลล์ Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) ถูกแยกออกจากเซลล์ iSLK.219 ซึ่งเก็บกัก recombinant KSHV.219 (rKSHV.219) [87] เซลล์ iSLK.219 ถูกคงรักษาไว้ใน DMEM ที่เสริมด้วย FBS ที่ปราศจากเตตราไซคลีน 10%, G418 (250 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร), ไฮโกรมัยซิน (400 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) และพูโรมัยซิน (10 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) เพื่อผลิตไวรัสที่ติดเชื้อ เซลล์ถูกกระตุ้นด้วยด็อกซีไซคลิน 3 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร และโซเดียม บิวทีเรต 1 มิลลิโมลาร์ [88] หลังจาก 72 ชั่วโมง สารเหนือตะกอนถูกเก็บเกี่ยว และเศษเซลล์ถูกอัดเป็นก้อนและกรองผ่านตัวกรอง 0.45 ไมโครเมตรที่ปราศจากเชื้อ เพื่อตรวจสอบระดับการติดเชื้อ เซลล์ Vero ได้รับการรักษาด้วยไวรัสเข้มข้น และนับจำนวนเซลล์ที่แสดงออก GFP 48 ชั่วโมงหลังการติดเชื้อ หารจำนวนเซลล์ที่แสดงออก GFP ด้วยปริมาตรของไวรัสเข้มข้นที่ใช้หน่วยที่ติดเชื้อ (IU)/มล. เพื่อสร้างสายเซลล์ 293T.219 เซลล์ 7.5 x 105 HEK 293T ถูกเพาะในจาน 6 หลุมใน DMEM ที่เสริมด้วย 10% FBS (Sigma) หลังจาก 24 ชั่วโมง สื่อถูกเปลี่ยนเป็นตัวกลาง Opti-MEM I รีดิวซ์ในซีรัม (Thermo Fisher) และเซลล์ได้รับการรักษาด้วยไวรัสเข้มข้นที่การติดเชื้อหลายหลาก (MOI) เท่ากับ 1 ต่อหน้าโพลีเบรน (10 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) ) และปั่นหมาดที่ 2,500 รอบต่อนาที เป็นเวลา 90 นาที ที่อุณหภูมิ 30°C ทันทีหลังการหมุนเหวี่ยง ตัวกลางถูกเสริมด้วย FBS 10% และเซลล์ถูกบ่มที่ 37°C เป็นเวลา 16 ชั่วโมงก่อนที่จะเปลี่ยนอาหารเป็น DMEM ที่เสริมด้วย FBS 10% ในการเลือกเซลล์ที่ติดเชื้อที่เสถียร สื่อถูกเสริมด้วย puromycin (1 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) 48 ชั่วโมงหลังการติดเชื้อ และเซลล์ถูกคงรักษาไว้ในอาหารเลี้ยงเชื้อแบบคัดเลือกนี้ต่อจากนี้ไป สายเซลล์ U2OS-ΔUSP24 ถูกสร้างขึ้นโดยใช้ CRISPR/Cas9 ตามที่อธิบายไว้ที่อื่น [ 86. โดยสังเขป เซลล์ U2OS-Cas9 เติบโตจนเกิดการบรรจบกัน 80% และแปลงสัญญาณด้วยอนุภาคการถ่ายโอนข้อมูล CRISPR gRNA lentiviral (หลายหลากของการติดเชื้อ 5.0, Sigma-Aldrich) ที่มี sgRNA จำเพาะของ USP24 (sgRNA-1: 5'-GATGGCCGGTACACTTACC-3', โคลน ID HSPD0000072983 sgRNA-2: 5'-TCGAGCCACTTAAGCCTCC-3', ID โคลน HSPD0000072984 sgRNA-3: 5'-AAGTTTGATCGCTTGTCAT-3', ID โคลน HSPD0000072986) โดยใช้โพลีเบรนและสปินเฟกชัน 10μg/ml (1000xg, 90 นาที) เซลล์ที่ทรานส์ดิวซ์ถูกเลือกด้วยบลาสซิซิดิน 10 มก./มล. และพูโรมัยซิน 5 ไมโครกรัม/มล. การลบ USP24 ได้รับการยืนยันโดย PCR (ไพรเมอร์ไปข้างหน้า 5'-ACACAAGGCCTGATACCTCC-3' และไพรเมอร์ย้อนกลับ 5'-ACTGCAAATTCTCATTACCACTTT-3') และอิมมูโนบล็อตติงด้วยสารต้าน USP24 Ab

โครงสร้างพลาสมิด

PG13-luc (pGL13) พลาสมิดนักข่าว luciferase หิ่งห้อยที่มีองค์ประกอบการจับ p53 สิบสามองค์ประกอบและ pCMV-Neo-Bam และเวกเตอร์ที่แสดงการกลายพันธุ์แบบ wild-type และ dominant-negative p53 pCMV-Neo-Bam-p53WT และ pCMV-Neo-Bam- p53R273H (pC53-4.2N3)ตามลำดับ ถูกอธิบายไว้ที่อื่น [89,90] pGL3-เวกเตอร์ควบคุมพื้นฐานที่แสดงลูซิเฟอเรสหิ่งห้อยภายใต้โปรโมเตอร์ SV40 ถูกซื้อจาก Promega โครงสร้างพลาสมิดที่แสดง orfs ที่เข้ารหัสโดยไวรัสซิก้า (ZIKV), ไวรัสชิคุนกุนยา (CHIKV), อีโบลา, ไข้หวัดใหญ่ A, โรคทางเดินหายใจเฉียบพลันรุนแรง (โรคซาร์ส), Middle East Respiratory Syndrome (MERS) coronavirus (MERS-CoV), bat CoV, Kaposi Sarcoma Associated Herpesvirus (KSHV) (ตาราง S1 https://www.med.unc.edu/orfeome) ถูกโคลนโดยใช้ระบบการโคลนเกตเวย์ ( อินวิโทรเจน) ชุดย่อยของโครงสร้าง orf ถูกสังเคราะห์โดย Bio Basic, Amherst New York เวกเตอร์นักข่าว NLS-mCherry-NES (pDN160) เป็นของขวัญจาก Barbara Di Ventura และ Roland Eils (Addgene plasmid # 72660 http://n2t.net/addgene:72660 RRID:Addgene_72660 [91]) pOME0304, pOME0004, pOME0184 ที่อ้างถึงเป็น pDEST47-ZIKV NS2A-Flag, pDEST47-KSHV orf10-Flag และ pDEST47-KSHV orf57-Flag ตามลำดับ โปรตีนด่วนที่หลอมรวมกับเอพิโทป 3xFlag ที่ปลาย C (ตาราง S1) เวกเตอร์ที่แสดง KSHV orf45 และ KSHV orf25 ที่ติดแท็กด้วย C-terminal Strep-tag เรียกว่า 'KSHV orf45g' และ 'KSHV orf25g' ตามลำดับถูกอธิบายไว้ที่อื่น [42] ข้อมูลการควบคุมคุณภาพ แผนที่พลาสมิด และลำดับทั้งหมดมีอยู่ในเว็บไซต์ ORFEOME ลำดับพลาสมิดยังมีให้บริการผ่าน VIPR

ยาและแอนติบอดี

อีโทโพไซด์ (MP Biomedicals, 02193918-CF), nutlin-3 (Millipore Sigma, N6287), MG132 (Cayman Chemicals, 10012628), N-Ethylmaleimide (NEM, Millipore Sigma, E3876), leptomycin B (LMB, Millipore Sigma, L2913) , สารป้องกันการติดธงของเมาส์ (M2, Millipore Sigma, F1804), ตัวป้องกันกระต่าย -Flag (D6W5B, การส่งสัญญาณของเซลล์, 14793), ตัวป้องกันเมาส์ -p53 pAb421 (Novus Biologicals, NBP2-62555), ตัวป้องกันเมาส์ -p53 (DO-7, Invitrogen, MA5-12557), rabbit anti -p53 pSer15 (Cell Signaling, 9284), mouse anti -ATM (11G12, Cell Signaling, 92356), Rabbit anti -ATM pSer1981 (D25E5, Cell Signaling, 13050), เครื่องต่อต้านเมาส์ -ATR (2B5, GeneTex, GTX70109), ตัวป้องกันกระต่าย -ATR pSer428 (การส่งสัญญาณของเซลล์, 2853), ตัวป้องกันเมาส์ -p21 (187, Santa-Cruz, sc-817), ตัวต่อต้านกระต่าย -H2AX (การส่งสัญญาณมือถือ, 2595), ตัวป้องกันกระต่าย - H2AX pSer139 (20E3, การส่งสัญญาณของเซลล์, 9718), แอนติ -actin ของเมาส์ (Abcam, ab8226), สารต้านกระต่าย -USP24 (Abcam, ab72241), สารต้านกระต่าย -ubiquitin (การส่งสัญญาณของเซลล์, 3933), สารต้านกระต่าย -NUP98 (C39A3, เซลล์ การส่งสัญญาณ, 2598), สารต้านกระต่าย -Exportin-1/CRM1 (D6V7N, เซลล์ S ignaling, 46249), เมาส์ TrueBlot (Rockland, 18-8817-33), horse anti -mouse horse reddish peroxidase (HRP) conjugated (Vector Laboratories, PI-2000), แพะต่อต้านกระต่าย HRP (Vector Laboratories, PI-1000) , สารต่อต้านเมาส์สำหรับม้าที่ผสานเข้ากับฟลูออเรสซิน ไอโซไธโอไซยาเนต (FITC, Vector Laboratories, FI-2000), ต่อต้านกระต่ายกระต่าย Texas Red (Vector Laboratories, TI-1000), VectaFluor Excel Dylight 488 แอนตี้เมาส์ IgG (Vector Laboratories, DK-2488 ), VectaFluor Excel Dylight 594 ต่อต้านกระต่าย IgG (Vector Laboratories, DK-1594), p53-N-term-Trap-A (epitope AA 1–8, ChromoTek, pta-10), p53-C-term-Trap- A (epitope AA 302–393, ChromoTek, pta2-10), Binding control (ChromoTek, bab-20), Protein A/G Plus-agarose (Santa Cruz, sc-2003)

P53-Luc ทดสอบ

สำหรับ 'พลาสมิด P53-overexpression' เซลล์ HEK293 ถูกทรานส์เฟกร่วมกับ pGL13, pCMV-Neo-Bam-p53WT และอีเธอร์ pCMV-Neo-Bam, pCMV-Neo-Bam-p53R273H หรือเวกเตอร์ซึ่งแสดงหรือสนใจโดยใช้ Lipofectamine 2000 (Invitrogen, 11668027) ตามโปรโตคอลของผู้ผลิต ที่ 24 ชั่วโมงหลังการถ่าย (p.t.) ระดับการแสดงออกของลูซิเฟอเรสถูกวัดโดยใช้ระบบการทดสอบ ONE-Glo luciferase (Promega, E6110) สำหรับการเหนี่ยวนำของ p53 ภายในร่างกายด้วย etoposide หรือ nutlin-3 เซลล์ U2OS ถูกทรานส์เฟกด้วย pGL13 และ pCMV-Neo-Bam, pCMV-Neo-Bam-p53R273H หรือเวกเตอร์ที่แสดงหรือสนใจโดยใช้ Lipofectamine 2000 ที่เวลา 18 ชั่วโมง pt เซลล์ถูกซ้อนทับด้วยอาหารสดที่มี 5 μM etoposide หรือ 10 μM ของ nutlin-3 และฟักเป็นเวลา 24 ชั่วโมงเพิ่มเติมก่อนวัดการแสดงออกของ luciferase ด้วย ONE-Glo luciferase ระบบทดสอบ ความอยู่รอดได้ของเซลล์เพื่อกำหนดหาความเป็นพิษต่อเซลล์ของแต่ละออร์ฟที่แสดงออกหรือการบำบัดด้วยยาถูกวัดด้วยการสอบวิเคราะห์ความอยู่รอดของเซลล์ที่เรืองแสงได้ CellTiter-Glo (Promega, G7570)

ภูมิคุ้มกันบกพร่อง

เซลล์ U2OS ถูกทรานส์เฟกด้วยเวกเตอร์ที่แสดงความสนใจโดยใช้ Polyethylenimine (PEI, Linear, MW 25000, Polysciences, Inc., 23966–1) ตามโปรโตคอลที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้โดยมีการดัดแปลงเล็กน้อย [92] สารละลาย DNA PEI ถูกเตรียมที่อัตราส่วน 1:3 ใน Opti-MEM (Gibco, 31985062) และบ่มเป็นเวลา 10 นาทีที่อุณหภูมิห้อง (RT) ก่อนเติมลงในเซลล์ ที่ 18 ชม. p.i เซลล์ถูกกระตุ้นด้วยอีโตโพไซด์ 10 ไมโครโมลาร์หรือไม่ก็ปล่อยทิ้งไว้ไม่บำบัดและจากนั้นบ่มเป็นเวลา 24 ชั่วโมงเพิ่มเติม เซลล์ที่เก็บเกี่ยวถูกสลายใน 50mM Tris (pH7.4)-5mM กรดเอทิลีนไดเอมีนเตตระอะซิติก (EDTA)-0.5% Nonidet P-40 (NP-40)-150mM NaCl-5% ซูโครส (TENN) ที่เสริมด้วยค็อกเทลตัวยับยั้งโปรตีเอส cOmplete (Millipore Sigma, 11697498001) เป็นเวลา 30 นาทีบนน้ำแข็ง โดยมีการหมุนวนเป็นบางครั้ง และหมุนลงไปที่ 15,000xg เป็นเวลา 10 นาที ไลเซตถูกล้างล่วงหน้าโดยการฟักไข่ด้วยโปรตีน A/G บวกลูกปัดอะกาโรส (Santa-Cruz, sc-2003) หรือ 'สารควบคุมการจับ', เม็ดอะกาโรสที่ไม่คอนจูเกต (ChromoTek, bab-20) และภูมิคุ้มกันร่วมกับหนูตัวใดตัวหนึ่ง แอนติบอดีต่อต้านธงและโปรตีน A/G บวกกับลูกปัดอกาโรสหรือ p53-ดักหนู-term_A และ p53-กับดัก C-term_A (ChromoTek, pta-10 และ pta2-10), โปรตีนคอนจูเกตที่มีอากาโรสจำเพาะสำหรับ p53 N- หรือ C-terminus ตามลำดับ เม็ดบีดถูกล้างด้วยบัฟเฟอร์ 50mM Tris (pH7.4)-5mM EDTA-1% หรือ 0.5% NP-40-500mM NaCl (SNNTE) ตัวอย่างถูกวิเคราะห์โดย immunoblotting กับ Ab ที่ระบุ

หน้า53 การทดสอบการแพร่หลาย

เซลล์ U2OS ที่ทรานส์เฟกด้วยเวกเตอร์ซึ่งแสดงออกหรือสนใจโดยใช้ PEI ตามที่อธิบายข้างต้นถูกบำบัดด้วย 30μM MG132 เป็นเวลา 6 ชั่วโมง และจากนั้นบ่มด้วย 10mM NEM เป็นเวลา 10 นาทีก่อนการเก็บเกี่ยว ตัวอย่างถูกสลายในบัฟเฟอร์ radioimmunoprecitation (RIPA) (50mM Tris (pH7.4)-150mM NaCl-1% Triton X-100-0.1% โซเดียมโดเดซิลซัลเฟต (SDS)-1% โซเดียมดีออกซีโคเลต) เสริมด้วย NEM 10mM, เบนโซเนสนิวคลีเอส (Millipore Sigma, E1014) และค็อกเทลสารยับยั้งโปรตีเอสที่สมบูรณ์ (Millipore Sigma, 1169748001) บนน้ำแข็งเป็นเวลา 30 นาที ไลเซตถูกปั่นแยกที่ 15000xg เป็นเวลา 10 นาทีที่ 4°C, เคลียร์ล่วงหน้าด้วยโปรตีน A/G บวกกับเม็ดบีด agarose เป็นเวลา 30 นาทีที่ 4°C และกระตุ้นภูมิคุ้มกันโดยการบ่มด้วยแอนติ-p53 pAb421 (18 ชม., 4°ซ) และโปรตีน ลูกปัด A/G บวก agarose (1 ชม., 4°C) The samples were washed with RIPA buffer and analyzed by immunoblotting with anti-ubiquitin Ab and anti-p53 Ab clone DO7.

Immunoblotting

For protein accumulation assay (Fig 2), cells were lysed in RIPA buffer supplemented with Benzonase nuclease, and complete protease inhibitor cocktail. Otherwise, the samples were prepared as indicated. The samples were separated on 6% or 12% SDS- polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), transferred to Polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane, blocked with 10% skim milk, and blotted with indicated Ab diluted either in 5% skim milk or 5% BSA.

อิมมูโนฟลูออเรสเซนซ์

The cells were plated onto coverslips and transfected with an expression vector. U2OS cells were transfected with PEI as described above. U87-MG and A549 cells and HUVEC cells were transfected with Lipofectamine LTX (Invitrogen, 15338100) according to the manufacturer’s protocol. At 18h p.t., the cells were stimulated with 10 μM etoposide for 1.5-2h and fixed/ permeabilized with ice-cold 100% methanol. Flag-conjugated proteins were stained with either mouse or rabbit anti-Flag Ab and goat anti -mouse or goat anti -rabbit Ab conjugated to TexasRed or fluorescein isothiocyanate (FITC). Endogenously expressed cellular proteins were stained with one of the following Ab (mouse anti -p53 DO7, rabbit anti -p53 pSer15, mouse anti -p21, rabbit anti -USP24, mouse anti -ATM, rabbit anti -ATM pSer1981, anti -ATR, and anti -ATR pSer428) and either VectaFluor Excel Amplified DyLight 594 Anti-Rabbit IgG Kit or VectaFluor Excel Amplified Dylight 488 anti-Rabbit IgG Kit (Vector Laboratories). The nuclei were stained with 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). Z-stack images collected using LEICA DM4000B epi-fluorescence microscope by setting the lowest and highest plane of Z-axes were subjected to deconvolution using SimplePCI_5 version 6.2 microscope software. The individual optical sections were exported to multipage TIFF format and processed using Imaris version 7.1.0 software (Bitplane).

การวิเคราะห์ทางสถิติ

All analyses were conducted using the R statistical language (version 3.5.3). The response curve of the screen was tested for “Normality” by QQ-plot and Shapiro–Wilk test and the contribution of individual orfs identified by general linear model. Dunnett's test was used to adjust for multiple comparison relative to “vector” and significance level alpha was set at p≤0.05.


วิธีการ

Sequences and cloning

The DNA sequence of the DI genome (GenBank accession number: MW250351) was designed to correspond to the following three joint portion s of the SARS-CoV-2 complete genome (the NCBI Reference Sequence for SARS-CoV-2 GenBank accession number: NC_045512.2), in the following order: 1 to 789 19674 to 20340 and 28477 to 29903. The DI0 genome (GenBank accession number: MW250350) was designed to correspond to the following two joint fragments of SARS-CoV-2 in the following order: 1 to 473 29576 to 29903. In both cases, the first nucleotide of the first fragment was changed from A to C in order to improve in vitro transcription efficiency [Milligan 1987, Martin & Coleman 1987]. The synthetic sequence was analysed using the Vienna RNA package [Lorenz et al. 2011] to confirm the absence of potential aberrations in the RNA secondary structure. The DI and DI0 genome DNA were assembled from synthetic oligonucleotides and inserted into a pMA-RQ plasmid by Invitrogen (Thermo Fisher Scientific). The T7 promoter TAATACGACTCACTATAGG was synthetised immediately upstream of the 5’ end of the synthetic virus sequence. A short sequence (CCATGG) containing the NcoI restriction site was synthetised immediately upstream of the 5’ end of the T7 promoter, and a short sequence (CCGGT) containing the AgeI restriction site was synthetised immediately downstream of the 3’ end of the third fragment. The plasmid DNA was purified from transformed bacteria and the final construct was verified by sequencing.

การถอดความในหลอดทดลอง

The plasmid containing the synthetic DI or DI0 genomed DNA was linearized using NcoI and AgeI and resuspended in H2O. 1 μg was then used as a template to produce capped RNA via T7 RNA polymerase, using a single reaction setup of the mMESSAGE mMACHINE® Kit (Applied Biosystems), which contains: 2 μL enzyme mix (buffered 50% glycerol containing RNA polymerase, RNase inhibitor, and other components) 2 μL reaction buffer (salts, buffer, dithiothreitol, and other ingredients) 10 μL of a neutralized buffered solution containing: 15 mM ATP, 15 mM CTP, 15 mM UTP, 3mM GTP and 12mM cap analog [m7G(5’)ppp(5’)G] 4 μL nuclease-free H2O incubated for 2 hours at 37°C. RNA was isolated using TRIzol reagent (Invitrogen) extraction and isopropanol precipitation.

Cells and transfection

Vero-E6 cells (Chlorocebus sabaeus kidney epithelial cells [Yasumura & Kawakita 1963]) cultured in DMEM medium (Hyclone, #SH30022.FS) supplemented with 10% fetal bovine serum (Corning, #35-011-CV), 100 units ml −1 penicillin and 100 μg ml −1 streptomycin (Gibco, #15140122) maintained at 37 °C and in a 5% CO2 atmosphere were grown to 80% confluence. The cells were electroporated with the RNA produced by in vitro transcription (DI: 532ng DI0: 476ng per 200,000 cells equivalent to 1.7×10 6 and 5.6×10 6 RNA molecules per cell, respectively), in 100 μl Nucleocuvette Vessels using the SF Cell solution and program DN-100 on a 4D Nucleofector X unit (Lonza). The efficiency of transfection was approximately 90%. Cells used for the control experiments were electroporated in the same way but without RNA.

Virus culture

SARS-CoV-2 isolate USA-WA1/2020 was obtained from BEI resources (#NR-52281) and propagated in Vero-E6 cells. Virus stocks were prepared and the titer as determined by plaque assays by serially diluting virus stock on Vero-E6 monolayers in the wells of a 24-well plate (Greiner bio-one, #662160). The plates were incubated at room temperature in a laminar flow hood with hand rocking every ten minutes. After one hour, an overlay medium containing 1XMEM, 1% Cellulose (Millipore Sigma, #435244), 2% FBS and 10mM Hepes 7.5 was added and the plates were incubated for a further 48 hours at 37 0 C. The plaques were visualized by standard crystal violet staining. All work with the SARS-CoV-2 was conducted in Biosafety Level-3 conditions at the Eva J Pell Laboratory of Advanced Biological Research, The Pennsylvania State University, following the guidelines approved by the Institutional Biosafety Committee.

Coinfection and RNA extraction

200,000 transfected cells were seeded in each well of a 24-well plate (each well in triplicate), and incubated for 1 hour before being inoculated with SARS-CoV-2 at MOI=10. The medium containing the infectious SARS-CoV-2 viruses was removed after 1 hour and replaced with fresh medium. Cells were allowed to grow for 4, 8, 12 or 24 hours before RNA was extracted. The supernatant of cultures grown for 24 hours was used to infect new cells in 24-well plates for one hour, then media was replaced with fresh media and RNA was extracted from the cells after another 24 hours. This step was repeated four times to obtain RNA from four consecutive passages. RNA was extracted using Quick RNA miniprep kit (Zymo, #R1055) or TRIzol reagent (Invitrogen, #15596026) followed by isopropanol precipitation.

RNA analysis

Equal amounts of total RNA were reverse transcribed into first-strand cDNA using Revert Aid™ First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas). 2 μl diluted cDNA (3pg-100ng depending on the experiment) mixed 2 μl of 5 μM primer mix (forward plus reverse), 1 μl of 2 μM of probe and 5 μl master mix (2×) was used for qRT-PCR using TaqMan assay on a StepOnePlus instrument (Applied Biosystems) starting with polymerase activation at 95°C for 3 minutes, followed by 40 cycles of denaturation (95°C, 15 seconds) and annealing/extension (60°C, 1 minute). The amount of WT and synthetic DI or DI0 genome were quantified (using StepOnePlus Software 2.3) by the comparative CNS method [Livak and Schmittgen 2001]. All results were normalised with reference to the actin beta (ACTB) gene of Chlorocebus sabaeus each sample was repeated three times and the average value was used all absolute values reported are 2 −ΔCT values. Primers and probes for the DI and DI0 genomes were designed to amplify one of the junctions between portions of the WT genome [รูปที่ 1] for the virus we used a modified version of the CCDC primer-probe set on ORF1. A BLAST search revealed no off-target sequences neither in the SARS-CoV-2 nor in the Chlorocebus sabaeus จีโนม Primers and probes for the DI and DI0 genomes, for the SARS-CoV-2 genome, and for the ACTB gene of Vero-E6 cells, were labelled using the FAM dye, an IBFQ quencher and an additional internal (ZEN) quencher, and were synthetised by Integrated DNA Technologies. The sequences are the following:


Conclusions: Prospects for EV Therapy

A growing body of evidence indicates that cells infected with enveloped or nonenveloped viruses release EVs that contain viral components. Here, we aimed to create awareness that virus preparations may never be pure but rather are contaminated with diverse subpopulations of EVs, and some of these EVs may be either indistinguishable from or very similar to so-called defective viruses. Because of their common biogenesis paths, viruses and EVs may be close relatives, although only the former can replicate in cells. Importantly, EVs generated by infected cells are not neutral, as they can either facilitate virus propagation or enhance the antiviral response. Understanding of the structure of EVs produced by infected cells, determining their cargo, and deciphering the fine mechanisms by which they affect viral infection are required not only for basic virology but also for translation into therapy. Below, we present three examples of potential utilizations of EVs in immunotherapy, vaccine development, and drug delivery:

(ผม) EVs with viral proteins can serve as decoys for antiviral antibodies by binding them, leaving infectious virions partially undetected. Eliminating these EVs (e.g., with immunoadsorption based on their nonviral markers) may enhance antiviral immune responses. (ii) Understanding the roles of EVs in antiviral immune reactions may guide engineering of EVs that have strong antiviral properties. (สาม) Knowledge of phenotypes and functions of EVs generated in response to viral inoculation can in the future be applied to improve virus vaccines by eliminating or adding defined subsets of EVs.

Targeted drug delivery is one of the most important and unresolved problems in pharmacology. By contrast, viruses are highly targeted: in the course of evolution they have acquired high specificity toward their cellular targets by incorporating specific binding proteins. Incorporation of such viral proteins onto the EV membrane may facilitate EV-mediated delivery of drugs to specific cells (63).

However, to achieve these goals several important questions need to be answered regarding the role of EVs in intercellular communication in the steady state and during viral infections:

ผม) What are the exact mechanisms by which EVs affect viral infection at both cellular and systemic levels?

ii) Can we use new technologies, some of which are described in this report, to obtain viral preparations free of contaminating EVs and, reciprocally, EV preparations produced by infected cells and free of contaminating viruses? Only after we can obtain clean populations, can question # 1 be addressed experimentally.

สาม) How can we predict either in vitro or in vivo net biological activity when viruses and EVs are mixed?

iv) Can we obtain EVs with specific (viral) surface proteins to target vesicles to particular cells and organs?

วี) Can we efficiently scale up the production of EVs so that we have sufficient quantities to test their in vivo effects and even perform clinical trials in the future?

vi) Can we design and engineer EVs that block newly evolving viruses? Can we, for example, use EVs to block Zika viral infection developing in fetuses or to enhance antiviral activity to new influenza strains?

Answers to these questions will show whether the newly emergent field of extracellular vesicle research will become important for understanding fundamental mechanisms of virus infections and be translated into anti-viral therapeutic strategies.



ความคิดเห็น:

  1. Jabir

    I apologize for interfering ... I am aware of this situation. เข้าสู่เราจะพูดคุย

  2. Bernardyn

    ยอดเยี่ยม



เขียนข้อความ