ข้อมูล

อะไรเป็นตัวกำหนดปริมาณข้อมูลที่คุณจะได้รับจากการทดสอบตามลำดับ

อะไรเป็นตัวกำหนดปริมาณข้อมูลที่คุณจะได้รับจากการทดสอบตามลำดับ



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

เมื่อมีคนทำการทดลองหาลำดับ สิ่งที่กำหนดจำนวนข้อมูลที่คุณได้รับจากเครื่อง (Illumina, PacBio, Nanopore ฯลฯ) หรือจะเรียกอีกอย่างว่าเครื่องรู้ได้อย่างไรว่าเสร็จ?


บนเครื่อง Illumina เครื่องมือจะทำงานได้มากเท่าที่คุณบอกให้ทำ ถ้าคุณบอกให้รัน 150 รอบ คุณจะได้ 150-mers เป็นเอาต์พุต


พื้นฐานการจัดลำดับ

การจัดลำดับการเรืองแสงอัตโนมัติใช้รูปแบบหนึ่งของโปรโตคอลการยกเลิกสายโซ่ Sanger ที่พัฒนาขึ้นเมื่อ 20 ปีที่แล้ว ในวิธีนี้ DNA ที่จะถูกจัดลำดับทำหน้าที่เป็นโมเลกุลต้นแบบซึ่งโอลิโกนิวคลีโอไทด์ (ไพรเมอร์) เสริมแบบสั้นจะหลอมเพื่อเริ่มการขยายและการขยายด้วยเอนไซม์ของบริเวณจำเพาะของ DNA สายคู่ ชิ้นส่วนที่สร้างขึ้นใหม่จะประกอบกับแม่แบบ DNA กระบวนการนี้เกิดขึ้นระหว่างปฏิกิริยาการหาลำดับตามวัฏจักร กระบวนการที่แต่ละตัวอย่างที่เราได้รับต้องผ่านเพื่อที่จะขยายและติดฉลากเรืองแสงสำหรับการตรวจจับบนซีเควนเซอร์ของเรา

ในปฏิกิริยาการหาลำดับของวงจรนี้ แม่แบบและไพรเมอร์จะถูกรวมเข้าด้วยกันกับส่วนผสมของปฏิกิริยาที่ประกอบด้วย dNTP, ddNTP ที่ติดฉลากเรืองแสง, เอนไซม์ Amplitaq FS polymerase และบัฟเฟอร์ ปฏิกิริยาการหาลำดับตามวัฏจักรประกอบด้วยสามขั้นตอน - การทำให้เสียสภาพ การหลอม และการขยาย - และเกิดขึ้นในวงจรความร้อน ซึ่งเป็นเครื่องมือที่ช่วยให้สามารถควบคุมความร้อนและความเย็นของปฏิกิริยาของเราได้ ขั้นตอนเหล่านี้ทำซ้ำเป็นเวลา 35 รอบเพื่อให้แน่ใจว่ามีการขยาย DNA ที่ติดฉลากเพียงพอ และใช้เวลาประมาณ 3 1/2 ชั่วโมงจึงจะเสร็จสมบูรณ์

ในระหว่างขั้นตอนการทำให้เสียสภาพซึ่งเกิดขึ้นที่ 96ºC ขั้นแรก DNA แม่แบบที่มีเกลียวคู่จะถูกแยกออกเป็นโมเลกุลที่มีสายเดี่ยว ที่ขั้นตอนการหลอม อุณหภูมิจะลดลงเหลือ 50ºC เพื่อให้โมเลกุลไพรเมอร์ขนาดเล็กสามารถค้นหาบริเวณเสริมของพวกมันบน DNA แม่แบบสายเดี่ยวและไฮบริไดซ์หรือการหลอมได้อย่างถูกต้อง จากนั้น อุณหภูมิจะถูกเพิ่มเป็น 60ºC (ขั้นต่อขยาย) เพื่อให้เอนไซม์ Taq polymerase เริ่มการรวมตัวของนิวคลีโอไทด์เข้ากับสายโซ่ที่กำลังเติบโตของชิ้นส่วนที่สร้างขึ้นใหม่ซึ่งประกอบกับแม่แบบ DNA แบบสายเดี่ยว ผลิตภัณฑ์ต่อเติมเหล่านี้เริ่มต้นที่ส่วนท้ายของไพรเมอร์และขยายไปในทิศทางที่ 3 การยุติลูกโซ่เกิดขึ้นระหว่างขั้นตอนการขยายนี้ ของผสมปฏิกิริยาของเรามีส่วนผสมของดีออกซีนิวคลีโอไทด์ (dNTP) และไดดีออกซีนิวคลีโอไทด์ (ddNTPs) ที่ความเข้มข้นที่สร้างความน่าจะเป็นทางสถิติที่จะรวมไดดีออกซีนิวคลีโอไทด์แทนดีออกซีนิวคลีโอไทด์ที่ตำแหน่งนิวคลีโอไทด์แต่ละตำแหน่งในชิ้นส่วนที่สร้างขึ้นใหม่ เมื่อรวม dNTP ส่วนย่อยใหม่จะเติบโตต่อไป ddNTP มีอะตอมไฮโดรเจนแทนที่จะเป็นหมู่ไฮดรอกซิลที่ปลาย 3 ฟุต และไม่สามารถมีส่วนร่วมในการขยายเพิ่มเติมได้อีก ดังนั้น เมื่อรวม ddNTP การยืดตัวของสายโซ่เพิ่มเติมจะถูกบล็อก และส่งผลให้มีจำนวนผลิตภัณฑ์ที่ถูกตัดปลายที่มีความยาวต่างกัน

เมื่อแยกจากกันโดยอิเล็กโตรโฟรีซิส "บันได" ของผลิตภัณฑ์ที่ถูกตัดปลายเหล่านี้จะก่อตัวขึ้น โดยแต่ละขนาดจะแตกต่างกันไปตามนิวคลีโอไทด์หนึ่งตัว โดยชิ้นส่วนที่ปลายสุดที่เล็กที่สุดจะวิ่งบนเจลได้เร็วที่สุด มี ddNTP ที่แตกต่างกันสี่ตัวที่สอดคล้องกับนิวคลีโอไทด์ของ DNA สี่ตัว และแต่ละ ddNTP มีสีต่างกัน ดังนั้น ชิ้นส่วนที่ถูกตัดทอนแต่ละส่วนจะมี ddNTP ที่ติดฉลากเรืองแสงที่ปลาย 3’ และบันไดลำดับจะประกอบด้วยแถบสี ลำดับนั้นสามารถกำหนดได้โดยการเชื่อมโยงสีของแถบบนเจลกับ ddNTP เฉพาะ และลำดับที่พวกเขาวิ่งบนเจล ดังนั้น แถบแรกและแถบที่เล็กที่สุดที่มองเห็นได้จะสอดคล้องกับนิวคลีโอไทด์ที่ติดฉลากแรกที่รวมอยู่ติดกับไพรเมอร์ทันที แถบที่สองจะเป็นชิ้นส่วนที่ประกอบด้วย 1 dNTP ที่ไม่มีป้ายกำกับและ 1 ตัวที่ติดป้ายกำกับ ddNTP ที่ยุติสายโซ่ที่กำลังเติบโตเหล่านั้น แบนด์ที่สามจะประกอบด้วย dNTPS ที่ไม่มีป้ายกำกับ 2 อัน ตามด้วย ddNTP ที่ติดป้ายกำกับ 1 อัน และต่อด้วยเจล

เมื่อตัวอย่างได้รับการขยายและติดฉลาก ตัวอย่างจะต้องถูกอิเล็กโตรโฟเรสเพื่อแยกชิ้นส่วนที่ติดฉลากและการแสดงภาพ ดังที่ได้กล่าวไว้ก่อนหน้านี้ ddNTPs มีการติดฉลากเรืองแสง สีย้อมที่แนบมาเป็นสีย้อมถ่ายเทพลังงานและประกอบด้วยสีย้อมผู้ให้พลังงานฟลูออเรสซีนที่เชื่อมโยงกับสีย้อมไดคลอโรโฮดามีนที่รับพลังงาน ระบบถ่ายเทพลังงานนี้มีความไวมากกว่าระบบสีย้อมเดี่ยวมาก และทำให้เราใช้ DNA ในการตรวจหาน้อยลง และยังช่วยให้เราจัดลำดับโมเลกุล DNA ที่มีขนาดใหญ่มากได้ในขณะนี้ เช่น BACs PAC และแม้แต่ DNA จีโนมของแบคทีเรียบางชนิด วิธีการที่ละเอียดอ่อนน้อยกว่าก่อนหน้านี้ไม่สามารถจัดการได้

ชิ้นส่วนที่ติดฉลากสีย้อมเหล่านี้จะถูกบรรจุลงในซีเควนเซอร์และระหว่างอิเล็กโตรโฟรีซิส ให้ย้ายผ่านเจลพอลิอะคริลาไมด์หรือโพลีเมอร์เหลว และแยกออกตามขนาด ตรงปลายเจลหรือเส้นเลือดฝอย พวกมันจะผ่านบริเวณที่มีช่องอ่านค่า ซึ่งด้านหลังจะมีลำแสงเลเซอร์ส่งผ่านไปด้านหลังตัวอย่างที่ย้ายมา เลเซอร์นี้กระตุ้นสีย้อมเรืองแสงที่ติดอยู่กับชิ้นส่วน แล้วปล่อยแสงที่ความยาวคลื่นเฉพาะสำหรับแต่ละสีย้อม แสงที่ปล่อยออกมานี้จะถูกแยกออกตามความยาวคลื่นโดยสเปกโตรกราฟบนกล้อง CCD ที่มีการระบายความร้อนด้วยประจุไฟฟ้า เพื่อให้สามารถตรวจจับการปล่อยแสงฟลูออเรสเซนต์ทั้งสี่ได้โดยใช้เลเซอร์ผ่านเพียงครั้งเดียว ซอฟต์แวร์รวบรวมข้อมูลจะรวบรวมความเข้มของแสงเหล่านี้จากกล้อง CCD ที่แถบความยาวคลื่นเฉพาะ หรือฟิลเตอร์เสมือน และจัดเก็บไว้ในคอมพิวเตอร์ของซีเควนเซอร์เป็นสัญญาณดิจิทัลสำหรับการประมวลผล จากนั้นซอฟต์แวร์การวิเคราะห์จะตีความความเข้มของการเรืองแสงที่จุดข้อมูลแต่ละจุดและกำหนดการตีความการเรียกฐาน

เครื่องมือวัดในห้องปฏิบัติการของเรา

ห้องปฏิบัติการจัดลำดับ DNA ของ Roswell Park ปัจจุบันใช้เครื่องวิเคราะห์ทางพันธุกรรม ABI PRISM 3130XL สองตัว เป็นซีเควนเซอร์ DNA ของเส้นเลือดฝอยอัตโนมัติที่ผลิตโดย Applied Biosystems 3130 แต่ละตัวใช้อาร์เรย์ 16 แคปิลลารีซึ่งสามารถเรียกใช้ตัวอย่าง 176 ตัวอย่างใน 24 ชั่วโมงโดยใช้การกำหนดค่าปัจจุบันของเรา หรือสูงสุด 384 ตัวอย่างใน 24 ชั่วโมงด้วยโปรโตคอลที่ให้ความยาวในการอ่านสั้นลง แต่อนุญาตให้มีปริมาณงานสูงสุด

ด้วย 3130 การใส่ตัวอย่างจะขึ้นอยู่กับการฉีดด้วยไฟฟ้า เมื่อวางแผ่นตัวอย่างลงบนดาดฟ้าโหลดของเครื่องมือ 16-capillary array จะจุ่มลงในหลุมตัวอย่าง 16 หลุมแรก แรงดันไฟจะถูกจ่ายและไอออนที่มีประจุลบ ซึ่งโดยหลักแล้วจะเป็นผลิตภัณฑ์ขยาย DNA แต่ซึ่งอาจรวมถึงสารที่รบกวน เช่น เกลือถูกฉีดเข้าไปในอาร์เรย์ของเส้นเลือดฝอย นี่เป็นเหตุผลหนึ่งว่าทำไม DNA จึงต้องสะอาดเป็นพิเศษสำหรับการวิ่งบน 3130 เนื่องจากไอออนที่มีประจุลบที่มีขนาดเล็กกว่า เช่น เกลือ จะถูกฉีดเข้าไปอย่างพิเศษและอาจรบกวนการย้ายถิ่นของชิ้นส่วนดีเอ็นเอ

พอลิเมอร์ที่ไหลผ่านของเหลวจะไหลผ่าน 16 เส้นเลือดฝอยในอาร์เรย์เพื่อทำหน้าที่เป็นเมทริกซ์การแยก อะลิควอตใหม่ของพอลิเมอร์จะถูกผลักเข้าไปในเส้นเลือดฝอยก่อนการวิ่งแต่ละครั้ง โดยจะชะล้างพอลิเมอร์ออกจากการวิ่งครั้งก่อน ก่อนหน้านี้ ห้องปฏิบัติการของเราใช้อาร์เรย์ของเส้นเลือดฝอยที่ยาวที่สุดที่มีให้สำหรับความยาว 3100, 80 ซม. และพอลิเมอร์ Applied Biosystems POP-4 สำหรับตัวกลางแยก การรวมกันนี้ให้ลำดับเบสที่มีประโยชน์ประมาณ 900 เบส และข้อมูลสำหรับตัวอย่างสิบหกตัวอย่างสามารถได้มาใน 3 ชั่วโมง 40 นาทีด้วยอาร์เรย์นี้และพอลิเมอร์ อย่างไรก็ตาม ตั้งแต่นั้นเป็นต้นมา เราได้พัฒนาโปรโตคอลการรันที่ได้รับการดัดแปลงซึ่งใช้พอลิเมอร์ใหม่ล่าสุดของ Applied Biosystems, POP-7 และอาร์เรย์ 50 ซม. พอลิเมอร์นี้ได้รับการพัฒนาโดยเฉพาะสำหรับซีเควนเซอร์ที่มีปริมาณงานสูงของ ABI (รุ่น 3730) และได้รับการแสดงว่าให้ความยาวในการอ่านที่ยาวขึ้นควบคู่ไปกับระยะเวลาการทำงานที่สั้นลง แต่ไม่รองรับการใช้งานกับรุ่น 3100 ก่อนการอัพเกรดเป็นรุ่น 3130 เรา โดยเฉลี่ยแล้วสามารถได้รับฐานข้อมูล Phred Q20 มากกว่า 900-950 ฐานด้วยโปรโตคอล "อ่านนาน" และฐาน 850-900 ของ Q20 ด้วยโปรโตคอล "การอ่านมาตรฐาน" โดยใช้โปรโตคอลที่แก้ไขของเรา โปรโตคอล "อ่านนาน" มีเวลาทำงาน 2 ชั่วโมง 45 นาที โปรโตคอล "การอ่านมาตรฐาน" ของเราเสร็จสมบูรณ์ใน 2 ชั่วโมง 5 นาที งานนี้บางส่วนได้นำเสนอใน Biotechniques (2004 มิ.ย.36(6):932-3). ด้วยการอัปเกรด 3130 เราสามารถรับความยาวการอ่านและคะแนนคุณภาพที่ใกล้เคียงกันในระยะเวลาที่สั้นกว่าเล็กน้อย

อิเล็กโตรโฟรีซิสได้รับการอำนวยความสะดวกโดยวงจรไฟฟ้าแรงสูงใน 3130 ประจุจะดำเนินการผ่านวงจรโดย DNA และไอออนในพอลิเมอร์ ไอออนในบัฟเฟอร์ที่ใช้ในเครื่องมือ และผ่านสายไฟฟ้าและอิเล็กโทรด 3130 สามารถกระจายความร้อนอย่างสม่ำเสมอและมีประสิทธิภาพจากแรงดันไฟฟ้านี้ เนื่องจากพื้นที่ผิวขนาดใหญ่ของเส้นเลือดฝอยซิลิกาที่หลอมละลาย คุณลักษณะนี้ช่วยให้สามารถใช้ไฟฟ้าแรงสูงได้ในระหว่างการอิเล็กโตรโฟรีซิส และด้วยเหตุนี้ ส่งผลให้เวลาการทำงานลดลงอย่างมากโดยไม่สูญเสียความละเอียด ซีเควนเซอร์ที่เก่ากว่า เช่น Applied Biosystems 377 ซึ่งใช้แผ่นเจลเพื่อแยกชิ้นส่วนดีเอ็นเอ ไม่สามารถกระจายความร้อนได้เช่นกัน และต้องทำงานช้าลงและนานขึ้นมากเพื่อให้ได้ความยาวที่อ่านได้ใกล้เคียงกับ 3130

การแยกส่วนลำดับจะผ่านเซลล์ตรวจจับที่ส่วนท้ายของอาร์เรย์ แฟรกเมนต์ที่สั้นกว่าจะย้ายเร็วกว่าแฟรกเมนต์ที่ยาวกว่าและผ่านเซลล์การตรวจหาตามลำดับนี้ ลำแสงเลเซอร์อาร์กอนไอออนทำให้อิเล็คตรอนบนสีย้อมที่ติดอยู่กับชิ้นส่วน DNA ตื่นเต้นกับสถานะพลังงานที่สูงขึ้น เมื่อพวกเขากลับสู่สภาพพื้นดิน พวกมันจะเรืองแสง การเรืองแสงที่ปล่อยออกมาถูกจับโดยกล้องอุปกรณ์ชาร์จคู่ (CCD) กล้องนี้ประกอบด้วยซิลิกาชิปที่มีจำนวนพิกเซลหลายพันพิกเซลซึ่งเก็บประจุไฟฟ้าตามสัดส่วนกับความเข้มของการเรืองแสงที่มาถึง จากนั้นกล้อง CCD จะแปลงข้อมูลเรืองแสงเป็นข้อมูลอิเล็กทรอนิกส์ซึ่งจะถูกโอนไปยังคอมพิวเตอร์เพื่อประมวลผล ซอฟต์แวร์จะประมวลผลข้อมูลนี้เพื่อสร้างอิเล็กโตรฟีโรแกรม โดยที่พีคแต่ละอันแสดงผลิตภัณฑ์ลำดับดีเอ็นเอหนึ่งส่วน

เราสามารถจัดลำดับ DNA ชนิดใดและเราต้องการเท่าใด

ห้องปฏิบัติการหาลำดับดีเอ็นเอสามารถจัดลำดับตัวอย่าง DNA ได้หลากหลาย รวมทั้งพลาสมิด คอสมิด ผลิตภัณฑ์ PCR ดีเอ็นเอฟาจสายเดี่ยว และสำเนาพันธุ์ BAC หรือ PAC เมื่อส่ง DNA สำหรับการหาลำดับ และหากคุณเตรียมไพรเมอร์สำหรับการจัดลำดับของคุณเอง ความเข้มข้นสำหรับ DNA ประเภทต่างๆ ควรปรับดังนี้:

ประเภทดีเอ็นเอ ความเข้มข้นที่ต้องการ ทั้งหมดที่ใช้ในปฏิกิริยา
พลาสมิด 200-250 นาโนกรัม/ul 500-700 ng
คอสมิด 200-250 นาโนกรัม/ul 500-700 ng
ผลิตภัณฑ์ PCR 10-20 ng/ul 10 ng/100 bp
ฟาจสายเดี่ยว 100-150 ng/ul 300 ng
BAC/PAC 300-400 นาโนกรัม/ul 700-900 ng
ไพรเมอร์แบบกำหนดเองของคุณ 1 ไมโครโมลาร์ = 1 pmol/uL =

* โปรดปรับความเข้มข้นของ DNA และไพรเมอร์ของคุณให้สอดคล้องตามข้อกำหนดด้านความเข้มข้นของเรา

ที่ความเข้มข้นที่ระบุไว้ข้างต้น เราจะใช้ประมาณ 3-4 ul ต่อปฏิกิริยา นอกจากนี้ การวัดเหล่านี้ไม่จำเป็นต้องเป็น 200ng/ul หรือ 10 ng/ul หรือค่าใด ๆ ก็ตามที่ใช้ได้ สิ่งเหล่านี้เป็นการประมาณว่าเราต้องการมากน้อยเพียงใด และหากคุณไม่ได้ใช้งานเพียงเล็กน้อย - พูด ให้ หรือรับ 30 ng/ ul สำหรับพลาสมิด 2-3 ng/ul สำหรับผลิตภัณฑ์ PCR ยังคงใช้ได้อยู่ เนื่องจากมีช่วงความเข้มข้นที่เราสามารถใช้ได้และยังคงได้รับข้อมูลลำดับที่ดี และหากผลตอบแทนของคุณต่ำกว่าข้อกำหนดของเรามาก เนื่องจากคุณมีทางเลือกสองทาง ขั้นแรก หากคุณมีสิทธิ์เข้าถึงเครื่องหมุนเหวี่ยงสุญญากาศ ให้แบ่งปริมาตรที่มีปริมาณ TOTAL ที่เราจะใช้ ผึ่งให้แห้งแล้วเติมลงในน้ำให้ได้ความเข้มข้นที่เราต้องการ ตัวอย่างเช่น หากความเข้มข้นของ DNA พลาสมิดเริ่มต้นของคุณเพียง 50 ng/ul ให้นำออก 10-15 ul เช็ดให้แห้งแล้วเติมน้ำ 3 ul หากคุณไม่มีสิทธิ์เข้าถึงเครื่องหมุนเหวี่ยงสุญญากาศ ให้จดบันทึกไว้ในช่องความคิดเห็นของแบบฟอร์มคำขอของคุณ แล้วเราจะใช้ตัวอย่างของคุณในปริมาณมากขึ้นในปฏิกิริยาการจัดลำดับวัฏจักรของเรา

อย่างไรก็ตาม พึงระลึกไว้เสมอว่าปริมาตรสูงสุดของ DNA ที่เราสามารถเพิ่มลงในปฏิกิริยาการหาลำดับคือ 10 ul ดังนั้น เพื่อให้ได้จำนวน DNA ขั้นต่ำที่ความเข้มข้นของคุณต้องไม่น้อยกว่า 50 ng/ul สำหรับพลาสมิดหรือคอสมิด 70 -90 ng/ul สำหรับตัวอย่าง BAC และ PAC หากความเข้มข้นของตัวอย่างของคุณต่ำกว่านั้น และคุณไม่สามารถเข้าถึงเครื่องหมุนเหวี่ยงสุญญากาศได้ แจ้งให้เราทราบแล้วเราจะสามารถทำให้แห้งในเครื่องหมุนเหวี่ยงของเรา หรือเราจะแสดงให้คุณเห็นวิธีการทำ อีกวิธีหนึ่ง คุณสามารถทำการตกตะกอนของเอทานอลและระงับอีกครั้งในปริมาตรที่น้อยลงเพื่อให้ตัวอย่างของคุณเข้มข้นขึ้น แต่อย่าลืมกำจัดเอทานอลออกทั้งหมด

โดยทั่วไป สำหรับผลิตภัณฑ์ PCR ผลผลิตจะไม่เป็นปัญหาหากเงื่อนไข PCR ของคุณได้รับการปรับให้เหมาะสมและมีประสิทธิภาพ อย่างไรก็ตาม หากคุณมีผลิตภัณฑ์ PCR ขนาดใหญ่ที่ต้องจัดลำดับ ซึ่งจะต้องใช้ DNA มากขึ้น (เช่น ผลิตภัณฑ์ PCR ขนาด 2 kb จะต้องใช้ DNA 100-150 ng) ดังนั้นคุณอาจต้องการเพิ่มขนาดปฏิกิริยาหรือพูลของคุณ ปฏิกิริยาหลายอย่างร่วมกัน นอกจากนี้ เมื่อจัดเตรียมไพรเมอร์แบบกำหนดเอง โปรดปรับความเข้มข้นของไพรเมอร์เป็น 1 uM หรือ 10 uM สำหรับตัวอย่าง BAC/PAC ที่ความเข้มข้นเหล่านี้ เราจะใช้ไพรเมอร์ 4 ul ต่อปฏิกิริยา เรามีไพรเมอร์เวกเตอร์ทั่วไปจำนวนหนึ่งสำหรับการจัดลำดับโดยไม่คิดค่าใช้จ่าย โปรดตรวจสอบลิงก์ที่ Primers ที่เราจัดเตรียมไว้เพื่อดูรายการทั้งหมด และเมื่อใดก็ตามที่เป็นไปได้ โปรดให้ DNA และไพรเมอร์เพียงพอสำหรับปฏิกิริยาสองปฏิกิริยา ในกรณีที่เราจำเป็นต้องทำปฏิกิริยาซ้ำไม่ว่าด้วยเหตุผลใดก็ตาม

การเลือกสายพันธุ์โฮสต์ของคุณ

การเลือกสายพันธุ์โฮสต์สำหรับการเตรียมแม่แบบถือเป็นข้อพิจารณาที่สำคัญ เนื่องจากบางสายพันธุ์จะให้คุณภาพ DNA ที่ดีขึ้นอย่างมากสำหรับการจัดลำดับอัตโนมัติ สายพันธุ์ E.Coli บางชนิดอาจปลดปล่อยปัจจัยบางอย่าง เช่น เอ็นโดนิวคลีเอสและคาร์โบไฮเดรตจำนวนมาก ในระหว่างการสลายซึ่งสามารถยับยั้งการเตรียมและการจัดลำดับดีเอ็นเอได้ นอกจากนี้ ส่วนประกอบของเซลล์บางอย่าง เช่น พอลิแซ็กคาไรด์ที่มีประจุบวก สามารถแข่งขันกับ DNA ในการจับในวิธีการเตรียม DNA ที่มีซิลิกาเป็นหลักซึ่งมักใช้ในชุดเครื่องมือทางการค้าจำนวนมาก ขอแนะนำให้ตรวจสอบกับผู้ผลิตสายพันธุ์เฉพาะเสมอเพื่อดูว่ามีปัญหาใด ๆ ที่อาจเกิดขึ้นเมื่อใช้สายพันธุ์กับแอปพลิเคชันของคุณหรือไม่ โฮสต์สายพันธุ์ที่ให้ข้อมูลที่เชื่อถือได้โดยทั่วไป ได้แก่ DH5alpha, DH10B, DH1, C600, XL1-Blue, XL10-Gold, TOP-10 และ NM294 XL1 Blue เติบโตช้ากว่าสายพันธุ์ส่วนใหญ่ และอาจส่งผลให้ผลผลิต DNA ลดลง แต่มักจะยังทำงานได้ดี ไม่แนะนำให้ใช้สายพันธุ์ เช่น JM101, JM83, HB101, TB1 และ TG1 เนื่องจากสามารถปล่อยปัจจัยยับยั้งจำนวนมากในระหว่างการสลาย ซึ่งอาจนำไปสู่ ​​DNA ที่มีคุณภาพต่ำซึ่งจะต้องมีขั้นตอนการทำให้บริสุทธิ์เป็นพิเศษ

ปัจจัยอื่นๆ ที่ควรพิจารณาในการเตรียมการเติบโตทางวัฒนธรรม ได้แก่ การเลือกอาหารเลี้ยงเชื้อและการเลือกยาปฏิชีวนะ ควรหลีกเลี่ยงการเติบโตของเซลล์มากเกินไป เนื่องจากเซลล์จะเริ่มสลายอย่างรวดเร็วหลังจากถึงระยะนิ่ง โดยปล่อยโครโมโซมและพลาสมิด DNA ที่เสื่อมโทรมจำนวนมาก รวมทั้งพอลิแซ็กคาไรด์ที่แยกออกได้ยากจากพลาสมิดดีเอ็นเอ โดยปกติแล้ว สื่อ LB มาตรฐานหรือสื่อที่อุดมด้วยบัฟเฟอร์มักจะแนะนำ เนื่องจากการเพาะเลี้ยงข้ามคืน 10-12 ชั่วโมงโดยทั่วไปจะให้ความหนาแน่นของเซลล์ที่เหมาะสมสำหรับการบรรจุลงบนคอลัมน์หรือเยื่อหุ้ม และนอกจากนี้ จะมีสัดส่วนที่ต่ำกว่ามากของวัสดุเซลล์ที่เสื่อมโทรมและดีเอ็นเอที่ปนเปื้อน . ทางที่ดีควรหลีกเลี่ยงสื่อเช่น TB หรือ 2xYT เนื่องจากพวกมันจะเข้าสู่ระยะคงที่เร็วกว่ามาก ดังนั้นการเพาะเลี้ยงในชั่วข้ามคืนจะทำให้เซลล์มีความหนาแน่นสูงอย่างไม่เหมาะสมรวมถึงเปอร์เซ็นต์ของสารยับยั้งที่มากขึ้น หากคุณควรใช้สื่อเช่นนี้ ขอแนะนำให้ตรวจสอบเวลาเพาะเลี้ยงและจำนวนเซลล์เพื่อหลีกเลี่ยงการปนเปื้อนของ DNA และการโหลดคอลัมน์มากเกินไป เคล็ดลับอย่างหนึ่งที่ต้องลองคือล้างเซลล์ที่อัดเป็นเม็ดด้วย 0.5M NaCl ก่อนทำการสลาย เพื่อช่วยกำจัดโพลีแซ็กคาไรด์และวัสดุสื่อที่อาจละลายร่วมกับ DNA ของคุณ แขวนตะกอนของคุณในสารละลาย 0.5 NaCl วอร์เท็กซ์ให้ดีแล้วหมุนอีกครั้ง โดยเอา supernatant ออกเมื่อเสร็จแล้ว

ควรเลือกใช้ยาปฏิชีวนะตลอดเพื่อหลีกเลี่ยงการเติบโตของเซลล์ที่ไม่มีพลาสมิด ในกรณีที่ไม่มีการคัดเลือกที่มีประสิทธิภาพ เซลล์ที่ไม่มีพลาสมิดจะเจริญเร็วกว่าเซลล์ที่มี ส่งผลให้ดีเอ็นเอที่ต้องการได้ผลผลิตไม่ดี นอกจากนี้ พลาสมิดบางชนิดจะเผาผลาญยาปฏิชีวนะบางชนิด เช่น แอมพิซิลลิน ในระหว่างการเจริญเติบโตของเซลล์ ดังนั้นจึงเป็นเรื่องสำคัญที่จะต้องจัดหาความเข้มข้นของยาปฏิชีวนะที่เหมาะสมเพื่อลดการพร่องให้เหลือน้อยที่สุด ยาปฏิชีวนะควรแยกส่วนและแช่แข็งเพื่อรักษาประสิทธิภาพสูงสุด

การเตรียมแม่แบบและการทำให้บริสุทธิ์

ความบริสุทธิ์และความเข้มข้นของเทมเพลตเป็นสองปัจจัยที่สำคัญที่สุดในการรับข้อมูลลำดับคุณภาพดี ความบริสุทธิ์และความเข้มข้นของเทมเพลตเป็นสองปัจจัยที่สำคัญที่สุดในการรับข้อมูลลำดับคุณภาพดี ไม่ นี่ไม่ใช่การพิมพ์ผิด เพียงแต่เราไม่สามารถเน้นหลักการนี้ได้เพียงพอเมื่อพูดถึงการจัดลำดับฟลูออเรสเซนต์อัตโนมัติ โดยเฉพาะอย่างยิ่งในรุ่น 3130 ของเราซึ่งต้องใช้วิธีการล้างข้อมูลที่เข้มงวดยิ่งขึ้น การจัดลำดับด้วยฟลูออเรสเซนต์นั้นไวต่อสารปนเปื้อนบางชนิดในตัวอย่าง DNA และ DNA ที่ถือว่าสะอาดเพียงพอสำหรับขั้นตอนทางอณูชีววิทยาอื่นๆ เช่น PCR การโคลน หรือแม้แต่การหาลำดับกัมมันตภาพรังสีด้วยตนเอง ไม่จำเป็นต้องสะอาดเพียงพอสำหรับการจัดลำดับด้วยฟลูออเรสเซนต์และอาจนำไปสู่ปัญหาที่ไม่ดี ข้อมูลคุณภาพหรือบางครั้งไม่มีข้อมูลเลย ในส่วนนี้ เราจะแสดงรายการคำแนะนำเกี่ยวกับวิธีที่ดีที่สุดในการทำความสะอาดและหาปริมาณ DNA ของคุณ โดยขึ้นอยู่กับประเภทของ DNA ที่คุณพยายามจะจัดลำดับ

Qiagen kits เป็นหนึ่งในวิธีการที่ได้รับการยอมรับในระดับสากลมากที่สุดในการให้ DNA คุณภาพสูงอย่างสม่ำเสมอสำหรับการจัดลำดับอัตโนมัติ นี่ไม่ได้หมายความว่าไม่มีวิธีอื่นที่ไม่ทำงาน - เราได้ระบุโปรโตคอลที่แนะนำอื่นๆ สองสามรายการ - แต่จากประสบการณ์ของเรา วิธีการล้างข้อมูลของ Qiagen มีเพียงประวัติการทำงานที่ดีที่สุดสำหรับความน่าเชื่อถือและความสม่ำเสมอในผลิตภัณฑ์ขั้นสุดท้าย

อีกทางเลือกหนึ่งที่มีให้สำหรับการทำให้ DNA บริสุทธิ์ที่ให้เทมเพลตคุณภาพสูงสำหรับการจัดลำดับ DNA แบบอัตโนมัติคือ Mini-Plasmid DNA Isolation kit ที่มีจำหน่ายที่ศูนย์บริการวิจัยชีวการแพทย์ (BRSC) ที่ SUNY Buffalo ชุดนี้เป็น "วิธีการเตรียมการสลายอัลคาไลน์ขนาดเล็กที่ได้รับการดัดแปลงและคล่องตัวจาก Sambrook et al. (Molecular Cloning, CSH, NY) ที่ขจัดความจำเป็นในการบำบัด RNase เพิ่มเติมและการสกัดฟีนอล-คลอโรฟอร์ม พลาสมิดดีเอ็นเอสามารถทำให้บริสุทธิ์ได้ง่ายและรวดเร็วจาก การเพาะเชื้อ E. coli ข้ามคืนใน 15 นาทีโดยให้ผล DNA ทั่วไป 1 – 5 มก. ต่อ 1 มล. ของการเพาะ DNA เหมาะสำหรับการย่อยแบบจำกัด การเตรียมโพรบ และการวิเคราะห์ PCR DNA ที่จะใช้สำหรับการวิเคราะห์ลำดับนั้นจะต้องได้รับ ขั้นตอนเพิ่มเติม 5 นาทีของการตกตะกอน PEG (PS-4) เพื่อกำจัดปริมาณ RNA ที่ติดตาม สามารถอ่านลำดับดีเอ็นเอคุณภาพสูงได้อย่างง่ายดาย (แก้ไขเกือบ 1,000 เบสต่อการเรียงลำดับ) หากพลาสมิด DNA ถูกแยกออกจาก E ที่เหมาะสม . coli โฮสต์ความเครียด ชุด (เพียงพอสำหรับ 300 mini-preps) มีความเสถียรอย่างน้อยหนึ่งปีหากจัดการและจัดเก็บอย่างถูกต้อง (นำมาจากเว็บไซต์ BRSC) ในราคา $95 สำหรับ 300 plasmid minipreps ชุดนี้มีราคาถูกกว่าชุด Qiagen อย่างมาก (ประมาณหนึ่งในสี่ของต้นทุน) รวดเร็วและใช้งานง่ายมาก เราได้เห็นโดยตรงแล้วว่าคุณภาพของ DNA ที่ได้จากชุดอุปกรณ์นี้เหมาะสำหรับการหาลำดับและเราขอแนะนำให้ใช้ชุดเครื่องมือนี้สำหรับการทำ DNA ให้บริสุทธิ์ BSRC เป็นทรัพยากรของ SUNY ในท้องถิ่นที่ส่งเสริมการวิจัยเชิงการแปลร่วมกัน พัฒนาและจำหน่ายผลิตภัณฑ์ที่เป็นนวัตกรรม และผลิตรีเอเจนต์การวิจัยที่มีคุณภาพสำหรับชุมชนวิทยาศาสตร์เพื่อชีวิตในวงกว้าง สำหรับข้อมูลเพิ่มเติมเกี่ยวกับ BSRC และผลิตภัณฑ์ต่างๆ คุณสามารถดูได้ที่เว็บไซต์: http://www.acsu.buffalo.edu/

ลิงก์ไปยังโปรโตคอลชุดแยก DNA มินิพลาสมิดสามารถดูได้ที่: โปรโตคอลการเตรียมมินิพลาสมิด

แม่แบบพลาสมิด

ข้อควรพิจารณาในการทำความสะอาดพลาสมิดเพรพ

คุณภาพของเทมเพลตไม่ดีเป็นหนึ่งในสาเหตุที่พบบ่อยที่สุดสำหรับข้อมูลลำดับที่ไม่ถูกต้อง ดังที่ได้กล่าวไว้ข้างต้น และเป็นข้อพิจารณาที่สำคัญในการเลือกวิธีการล้างพลาสมิดเพื่อให้ DNA มีความบริสุทธิ์ที่เหมาะสมที่สุดสำหรับการเรียงลำดับแบบอัตโนมัติ คุณภาพของเทมเพลตพลาสมิดอาจได้รับผลกระทบจากปัจจัยและสิ่งปนเปื้อนต่างๆ ดังต่อไปนี้:

  • เกลือหรือสารอินทรีย์ที่เหลือจากการเตรียมแม่แบบ
  • การปรากฏตัวขององค์ประกอบเซลล์เช่น RNA, โปรตีน, โพลีแซคคาไรด์หรือ DNA โครโมโซม
  • DNA ที่เสื่อมสภาพขณะเก็บรักษา
  • ค่าปรับซิลิกาที่ยกมาจากชุดเตรียมแม่แบบที่ใช้เรซินหลวมหรือสารละลายซิลิกา

ต่อไปนี้คือตารางสารปนเปื้อนที่อนุญาตและช่วงความเข้มข้นที่ยอมรับได้ ซึ่งจะยังช่วยให้มีข้อมูลการจัดลำดับที่ดี:

สารปนเปื้อน ปริมาณที่ยอมรับได้ในปฏิกิริยาการจัดลำดับ
RNA 1 ไมโครกรัม
ตรึง 0.3%
NaOAc 5-10mM
เอทานอล 1.25%
ฟีนอล 0%
CsCl 5mM
EDTA 0.25mM

ความคิดเห็นบางประการเกี่ยวกับผลกระทบของสารปนเปื้อนเหล่านี้บางรายการแสดงอยู่ด้านล่าง:

RNA - ดังที่คุณเห็นจากค่าในแผนภูมิด้านบน จริงๆ แล้ว RNA จำนวนมากสามารถทนต่อปฏิกิริยาการจัดลำดับได้ เป็นสารปนเปื้อนทั่วไปในพลาสมิด minipreps โดยเฉพาะอย่างยิ่งเมื่อคอลัมน์โอเวอร์โหลดและความจุของบัฟเฟอร์ lysis เกิน - การโอเวอร์โหลดอาจเป็นปัญหากับ Qiagen minipreps วิธีหนึ่งที่ RNA สามารถแทรกแซงได้คือเมื่อหาปริมาณการเตรียม DNA ของคุณโดยใช้สเปกโตรโฟโตมิเตอร์- RNA ยังดูดซับที่ 260 และเมื่อมีปริมาณมากก็จะสามารถลดความแม่นยำของความเข้มข้นของคุณได้ ดังนั้น เป็นการดีที่สุดที่จะจัดการกับการเตรียมแม่แบบของคุณด้วย RNase หรือการตกตะกอนของเกลือสูง และการหาปริมาณตัวอย่างของคุณทั้งโดยเจลและสเปกโตรสโกปี

ตรึง- การมีอยู่ของพอลิเอทิลีนไกลคอลที่ตกค้างในการเตรียมแม่แบบอาจส่งผลต่อการยับยั้งลำดับวัฏจักรของเอ็นไซม์ Taq polymerase และนำไปสู่สัญญาณอ่อน

เกลือ- กระบวนการของ Taq polymerase ที่ใช้ในปฏิกิริยาการหาลำดับวงจรลดลงเมื่อมีเกลือในปริมาณสูง การปนเปื้อนของเกลือในการเตรียมดีเอ็นเออาจเกิดจากการตกตะกอนของเกลือในการตกตะกอนของแอลกอฮอล์ การกำจัดส่วนเหนือตะกอนที่ไม่เพียงพอหลังจากการตกตะกอน หรือการล้างเม็ดด้วยเอทานอล 70% ที่ไม่สมบูรณ์ ควรใช้เทคนิคอย่างระมัดระวังเมื่อตกตะกอนด้วยแอลกอฮอล์ มันยังแสดงให้เห็นอีกด้วยว่าอะซิเตทไอออน ในทางตรงกันข้ามกับโซเดียม โพแทสเซียม หรือคลอไรด์ไอออน เป็นตัวยับยั้งปฏิกิริยาการจัดลำดับมากที่สุด เมื่อใช้โพแทสเซียมอะซิเตทหรือโซเดียมอะซิเตท ความเข้มข้นมากกว่า 20 มิลลิโมลาร์ทำให้ปฏิกิริยาการหาลำดับล้มเหลวอย่างสมบูรณ์ ในขณะที่ความเข้มข้นของโซเดียมคลอไรด์ 60 มิลลิโมลาร์นั้นจำเป็นก่อนที่จะทำการยับยั้งอย่างสมบูรณ์ เกลือสามารถยับยั้งได้เมื่อเราจัดลำดับตัวอย่างบน 377 แบบเจลของเรา แต่จะยิ่งมีปัญหามากขึ้นไปอีกเมื่อเรียกใช้ตัวอย่างบนระบบเส้นเลือดฝอย 3100 ของเรา เนื่องจากเกลือที่มีประจุขนาดเล็กกว่าเหล่านี้จะถูกฉีดเข้าไปและรบกวนการย้ายถิ่นของตัวอย่างดีเอ็นเอ

เอทานอล- การปนเปื้อนของเอทานอลสามารถเกิดขึ้นได้เมื่อตัวอย่างแห้งไม่เพียงพอหลังจากการตกตะกอนหรือเมื่อนำไปไว้ในบัฟเฟอร์สำหรับล้างที่มีเอทานอลซึ่งใช้ในขั้นตอนการแยกดีเอ็นเอบางวิธี การปนเปื้อนด้วยความเข้มข้นของเอทานอล 10% หรือมากกว่ามักจะนำไปสู่ความล้มเหลวของปฏิกิริยาการหาลำดับดีเอ็นเอ จำเป็นต้องทำให้ตัวอย่าง DNA แห้งโดยสมบูรณ์เพื่อขจัดเอทานอลเหล่านี้ออก

ฟีนอล- ฟีนอลอาจถูกส่งต่อจากวิธีการสลายดีเอ็นเออัลคาไลน์ที่ใช้ฟีนอลและคลอโรฟอร์มในการกำจัดโปรตีนและสารปนเปื้อนในเซลล์อื่นๆ ออกจากเซลล์ไลเสต ไม่สามารถทนต่อฟีนอลในปฏิกิริยาการหาลำดับของวัฏจักรได้เนื่องจากทำให้โปรตีนเสื่อมสภาพและจะทำให้เอนไซม์ Taq polymerase ที่ใช้ในปฏิกิริยาการหาลำดับของวงจรเสื่อมสภาพ คลอโรฟอร์มไม่มีคุณสมบัติในการทำให้เสียสภาพอย่างแรงของฟีนอล และดูเหมือนจะไม่ส่งผลเสียต่อปฏิกิริยาการจัดลำดับ

ซีเซียมคลอไรด์ - เมื่อใช้โปรโตคอลการไล่ระดับความหนาแน่นของความเข้มข้นของซีเซียมคลอไรด์ด้วยความเข้มข้นสูงเป็นพิเศษ จะได้รับ DNA ที่มีคุณภาพสูงมากซึ่งเหมาะสำหรับการจัดลำดับอัตโนมัติ อย่างไรก็ตาม ขอแนะนำอย่างยิ่งให้คุณฟอกไตตามด้วยการตกตะกอนของเอทานอล (วิธีที่ดีที่สุด) หรือทำการตกตะกอนไอโซโพรพานอลที่อุณหภูมิห้องน้อยที่สุดเพื่อขจัดซีเซียมคลอไรด์ที่ตกค้างทั้งหมด เนื่องจากซีเซียมสามารถยับยั้ง Taq polymerase ที่ใช้ในปฏิกิริยาการหาลำดับของวัฏจักร

EDTA - EDTA สามารถคีเลตแมกนีเซียมที่ต้องการโดย Taq polymerase ในปฏิกิริยาการหาลำดับตามวัฏจักร ดังนั้นเมื่อส่งตัวอย่าง เป็นการดีที่สุดที่จะเจือจางหรือแขวนตะกอนใน ddH20 หรือ 1X Tris buffer ที่ปลอดเชื้อ ไม่แนะนำให้ระงับในบัฟเฟอร์ TE แม้ว่าผู้คนจะทำมาแล้วและหลายครั้งก็ไม่มีปัญหา อย่างไรก็ตาม การให้แม่แบบ DNA ในน้ำเป็นเรื่องง่ายที่จะทำ และหากมีปัญหากับคุณภาพลำดับของคุณ ข้อเท็จจริงที่ว่าไม่มี EDTA ในตัวอย่างของคุณเป็นปัญหาที่อาจเกิดขึ้นอย่างหนึ่งที่เราสามารถกำจัดได้ทันที

หลักการชุด Qiagen

ดังที่ได้กล่าวไว้ข้างต้น Qiagen ผลิตชุดอุปกรณ์สำหรับการสกัดและการทำให้บริสุทธิ์ของ DNA ทุกประเภท รวมถึงพลาสมิด DNA ชุดพลาสมิดมินิเพรพของ Qiagen ประกอบด้วยเรซินแลกเปลี่ยนประจุลบที่ประกอบด้วยกลุ่ม DEAE ที่มีประจุบวกซึ่งผูกกับกระดูกสันหลังของดีเอ็นเอที่มีประจุลบเป็นพิเศษ เมื่อ DNA จับกับเรซินแล้ว สารปนเปื้อนอื่นๆ เช่น เกลือ โปรตีน RNA และคาร์โบไฮเดรต จะถูกชะล้างออกไปในบัฟเฟอร์ที่มีเกลือต่ำ ดีเอ็นเอจะถูกชะออกไปในขั้นตอนที่สอง โดยใช้บัฟเฟอร์ที่มีเกลือสูงเพื่อแยกส่วนออกจากเรซิน ชุดนี้ออกแบบมาเพื่อให้ DNA ที่มีความบริสุทธิ์สูงสุดและมีราคาค่อนข้างสูง ชุดเครื่องมืออีกชุดที่ Qiagen นำเสนอคือชุด Qiaprep ซึ่งใช้เมมเบรนที่มีซิลิกาเจลเป็นหลักในการจับ DNA ในที่ที่มีเกลือ Chaotropic ที่มีความเข้มข้นสูง เกลือจะถูกลบออกด้วยการล้างด้วยเอธานอล จากนั้น DNA จะถูกชะออกด้วยบัฟเฟอร์ทริสที่มีความแรงไอออนต่ำ วิธีนี้มาในรูปแบบคอลัมน์หมุนที่สามารถใช้ได้ทั้งในเครื่องหมุนเหวี่ยงหรือท่อร่วมสุญญากาศ ชุดนี้ให้ DNA ของความบริสุทธิ์ที่เหมาะสำหรับการเรียงลำดับและมีราคาไม่แพง อย่างไรก็ตาม มีปัจจัยบางอย่างที่ควรคำนึงถึงเมื่อใช้ชุด Qiagen หรือชุด miniprep แบบคอลัมน์อื่นๆ อย่างแรก อย่าใส่คอลัมน์มากเกินไป - RNA และโพลีแซ็กคาไรด์สามารถแข่งขันกับ DNA เพื่อจับกับเรซินของคอลัมน์และนำไปสู่ผลลัพธ์ที่ต่ำของ DNA พลาสมิดที่ต้องการ ทำตามคำแนะนำสำหรับการเจริญเติบโตของเซลล์และใช้สื่อ LB ตามที่แนะนำ ประการที่สอง อย่าลืมล้าง DNA ด้วยเอทานอล 70% หลังจากการตกตะกอนของไอโซโพรพานอลเพื่อขจัดเกลือส่วนเกิน การล้างด้วยเอทานอลสองถึงสี่ครั้งสามารถปรับปรุงคุณภาพ DNA และนอกจากนี้ การล้างเพิ่มเติมด้วยสารละลายยึดเกาะสามารถช่วยขจัดสิ่งปนเปื้อนอื่นๆ ประการที่สาม การอุ่นบัฟเฟอร์การชะของคุณสามารถช่วยปรับปรุงผลผลิตได้ และสุดท้าย ให้ขจัดเอทานอลทั้งหมดออกก่อนที่จะนำผลิตภัณฑ์สุดท้ายไปแช่ในน้ำ

วิธีการสลายด้วยอัลคาไลน์/PEG

แบคทีเรียสามารถสลายเพื่อปล่อยพลาสมิด DNA ได้หลายวิธี รวมถึงการบำบัดด้วยสารซักฟอก ตัวทำละลายอินทรีย์ ความร้อนหรือด่าง เมื่อพยายามแยกพลาสมิดขนาดใหญ่ (>15kb) ที่ไวต่อความเสียหายมากกว่าระหว่างขั้นตอนการสลาย ควรใช้วิธีการที่อ่อนโยนกว่า เช่น การปั่นเหวี่ยงที่สมดุลหรือการสลายที่เกี่ยวข้องกับสารซักฟอก เช่น SDS เมื่อทำการสลายเซลล์เพื่อเก็บเกี่ยวพลาสมิดที่มีขนาดเล็กกว่า สามารถใช้วิธีการที่แข็งแกร่งกว่า เช่น การบำบัดด้วยด่าง การรักษาเหล่านี้ทำให้ DNA โครโมโซมเชิงเส้นของโฮสต์เสื่อมสภาพและเสื่อมคุณภาพ พลาสมิด DNA แบบวงกลมปิดไม่แยกออกจากกันอย่างสมบูรณ์เนื่องจากพันกันทางทอพอโลยีและเมื่อสภาวะกลับสู่สภาวะปกติ เกลียวดังกล่าวจะฟื้นคืนสภาพได้อย่างแม่นยำในรูปแบบดั้งเดิมเป็นโมเลกุลซุปเปอร์เฮลิคัล

โปรโตคอลการแยกสลายด้วยด่างมาตรฐาน เมื่อรวมกับการตกตะกอนของ PEG สามารถนำไปสู่พลาสมิด DNA ขนาดเล็กที่มีความบริสุทธิ์เพียงพอสำหรับใช้ในการจัดลำดับฟลูออเรสเซนต์แบบอัตโนมัติ ต่อไปนี้คือโปรโตคอลโดยละเอียดสำหรับการบำบัดด้วยกระบวนการสลายด้วยด่าง/PEG ที่แนะนำโดย Applied Biosystems ผู้ผลิตลำดับดีเอ็นเอของเรา

หมายเหตุ: เพื่อลดการตัดเฉือนของ DNA โครโมโซมที่ปนเปื้อนให้น้อยที่สุด อย่าใช้กระแสน้ำวนในระหว่างขั้นตอนนี้

  1. เม็ด 1.5 -4.5 มล. แบ่งส่วนย่อยของวัฒนธรรมเป็นเวลา 1 นาทีในไมโครเซนตริฟิวจ์ที่ความเร็วสูงสุด
  2. ขจัด supernatant ด้วยความทะเยอทะยาน
  3. แขวนตะกอนแบคทีเรียอีกครั้งในบัฟเฟอร์ GET 200 ul โดยปิเปตขึ้นและลง
  4. เพิ่ม 300 ul ของ 0.2N NaOH/1% SDS ที่เตรียมสดใหม่ ผสมเนื้อหาของหลอดโดยการผกผัน ฟักบนน้ำแข็งเป็นเวลา 5 นาที
  5. ทำให้สารละลายเป็นกลางโดยเติมโพแทสเซียมอะซิเตท 3.0 โมลาร์ 300 ul, pH 4.8 ผสมโดยคว่ำหลอด ฟักบนน้ำแข็งเป็นเวลา 5 นาที
  6. ขจัดเศษเซลล์โดยการปั่นในไมโครเซนตริฟิวจ์ที่ความเร็วสูงสุดเป็นเวลา 10 นาทีที่อุณหภูมิห้อง ถ่ายโอนส่วนลอยเหนือตะกอนไปยังท่อที่สะอาด
  7. เติม RNase A (ปราศจาก DNase) ลงในความเข้มข้นสุดท้าย 20 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร ฟักไข่ที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 20 นาที
  8. สกัด supernatant สองครั้งด้วยคลอโรฟอร์ม:
    1. เพิ่มคลอโรฟอร์ม 400 ul
    2. ผสมเลเยอร์โดยผกผันเป็นเวลา 30 วินาที
    3. ปั่นแยกหลอดเป็นเวลา 1 นาทีเพื่อแยกเฟส
    4. ถ่ายโอนเฟสน้ำบนไปยังท่อที่สะอาด

    การทำให้บริสุทธิ์ซีเซียมคลอไรด์

    การทำให้บริสุทธิ์ของ DNA พลาสมิดโดยใช้วิธีการไล่ระดับความหนาแน่น เช่น การปั่นเหวี่ยงที่สมดุลในการไล่ระดับ CsCl-ethidium bromide สามารถให้ผล DNA ที่บริสุทธิ์มาก และมีประโยชน์อย่างยิ่งในการทำให้บริสุทธิ์พลาสมิดขนาดใหญ่หรือพลาสมิดขนาดเล็กที่จะใช้ในการทดลองที่เข้มงวดมากขึ้น เช่น การวัดทางชีวฟิสิกส์ โปรโตคอลนี้ใช้ประโยชน์จากข้อเท็จจริงที่ว่าเอธิเดียมโบรไมด์จะแทรกแซงในปริมาณที่แตกต่างกันเมื่อพบโมเลกุลดีเอ็นเอแบบเส้นตรงหรือแบบปิด เนื่องจากพันธะที่แตกต่างกันของสีย้อมนี้ ความหนาแน่นลอยตัวของ DNA แบบเส้นตรงและแบบวงกลมปิดที่เกิดขึ้นหลังจากการปั่นแยกจะแตกต่างกันในการไล่ระดับ CsCl ที่มีปริมาณเอทิเดียมโบรไมด์ที่อิ่มตัว ซึ่งช่วยให้แยกพลาสมิด DNA ออกจาก DNA โครโมโซมที่ปนเปื้อนได้อย่างมีประสิทธิผล DNA พลาสมิดแบบวงกลม RNA และโปรตีน วิธีการนี้เป็นมาตรฐานทองคำในการได้มาซึ่ง DNA ที่บริสุทธิ์มานานแล้ว แต่ค่อนข้างใช้เวลานานและมีราคาแพง ชุดเครื่องมือเชิงพาณิชย์หรือวิธีการสลายอัลคาไลน์ดัดแปลงให้ DNA ที่มีคุณภาพเพียงพอสำหรับการจัดลำดับอัตโนมัติ ดังนั้นจึงขจัดความจำเป็นในการใช้วิธีการที่เข้มงวดดังกล่าว อย่างไรก็ตาม หากการทำให้บริสุทธิ์ด้วยซีเซียมคลอไรด์เป็นวิธีที่คุณเลือก โปรโตคอลสามารถพบได้ในคู่มือ Maniatis Molecular Cloning

    หมายเหตุสุดท้ายเกี่ยวกับการทำให้บริสุทธิ์ด้วยพลาสมิด

    วิธีการสกัดดีเอ็นเอแบบเดือดไม่เป็นที่ยอมรับสำหรับการจัดลำดับอัตโนมัติ เว้นแต่จะสกัดด้วยฟีนอล/คลอโรฟอร์มเพื่อกำจัดโปรตีนทั้งหมด เอ็นโดนิวคลีเอสไม่ได้ถูกปิดใช้งานอย่างสมบูรณ์เสมอไปในระหว่างขั้นตอนการเดือด และพลาสมิด DNA สามารถย่อยสลายได้เมื่อมี Mg++ ในกระบวนการฟักตัวที่ตามมา

    และหากในท้ายที่สุด การเตรียมพลาสมิดของคุณยังไม่มีความบริสุทธิ์ที่เหมาะสมสำหรับข้อมูลลำดับที่ดีจากซีเควนเซอร์ของเรา ต่อไปนี้คือคำแนะนำบางส่วนสำหรับขั้นตอนการล้างเพิ่มเติมที่อาจช่วยได้:

    • ชำระ DNA ของคุณให้บริสุทธิ์ด้วยการกรองแบบอัลตราฟิลเตรชันโดยใช้คอลัมน์ Centricon-100 Micro-concentrator ดูโปรโตคอลที่คอลัมน์ Ultrafiltration/Molecular Weight Cutoff
    • ทำให้บริสุทธิ์ด้วยการสกัดเพิ่มเติม:
      1. สกัด DNA สองครั้งด้วยคลอโรฟอร์มหรือคลอโรฟอร์ม:ไอโซเอมิลแอลกอฮอล์ 1 ปริมาตร (24:1 ปริมาตร/ปริมาตร)
      2. เพิ่ม 0.16 ปริมาตรของ 5M NaCl และ 1 ปริมาตรรวมของ PEG 13%
      3. ฟักไข่บนน้ำแข็งเป็นเวลา 20 นาที จากนั้นหมุนเหวี่ยงที่ความเร็วสูงสุดในไมโครเซนตริฟิวจ์ที่ 2-6 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 20 นาที
      4. ล้างเม็ดสองครั้งด้วยเอทานอล 70%
      5. Dry the pellet in a vacuum centrifuge for 3-5 minutes or to dryness.
    • Purify using minimal isopropanol precipitations:
      1. Add 0.5 volume of 7.5M ammonium acetate or 0.1 volume of 3M sodium acetate to a dilute DNA solution (<100 ng/ul) and mix well.
      2. To this total volume, add 0.6 volume of room temperature isopropanol and mix well.
      3. Incubate at room temperature for 5 minutes, then centrifuge at maximum speed to pellet the DNA.
      4. Fill tube with 70% ethanol and do a complete wash of the pellet.
      5. Dry the pellet in a vacuum centrifuge for 3-5 minutes or to dryness.

    PCR products

    Considerations when cleaning up PCR products

    When submitting PCR products for direct sequencing, it is essential to separate the PCR product away from potentially interfering substances that may remain in solution after the PCR reaction. These contaminants can sometimes participate, and thus interfere, in the cycle sequencing reaction and lead to poor quality data or no data at all. Most importantly, primers and dNTPS should be removed. If both forward and reverse PCR primers remain in solution, they will both act as sequencing primers, resulting in multiple peaks from beginning to end as each primer can anneal to complementary strands with different nucleotide composition, and thus lead to overlapping fragments and unreadable data. Excess dNTPs should also be removed as they will upset the specific ratios of dNTPs/ddNTPs required for optimal extension and termination in the cycle sequencing reaction.

    Another consideration when choosing your PCR cleanup method is the determination of the presence of a single band or multiple bands that may result from your PCR reaction. Once the PCR reaction is completed, you should run a small aliquot on an agarose gel to assess its quality. If you have a single specific band, then it will be sufficient to remove excess PCR reactants using one of the methods listed below. If your PCR reaction generates multiple bands, an excessive amount of primer-dimers, or low-intensity smearing, it will then be necessary to run your PCR product out on a gel, excise your band of interest, and purify it away from the gel. Alternatively, you may want to spend some time optimizing your PCR reaction to eliminate the presence of these additional bands or artifacts and thus save yourself some downstream time in gel purifying your PCR products for sequencing.

    Regardless of which purification method you choose, you should always quantitate your PCR product after purification as no cleanup method will give 100% recovery. Any quantitative estimates you make when initially running your PCR product out on an analytical gel will be inaccurate as you will inevitably lose some product during purification, especially when gel purifying.

    Single PCR band

    Qiaquick PCR purification kit

    Qiagen makes PCR purification kits that come in either a microcentrifuge or vacuum manifold format, and can process anywhere from one PCR product using spin columns up to 96 samples in a 96 well plate. Fragments ranging in size from 100 bp up to 10 kb can be purified away from primers, dNTPs and salts that can interfere in the sequencing reaction. The protocol is simple and involves binding of DNA to the column or well membrane, washing away of contaminants, and elution of the DNA from the membrane. One nice thing about this kit is there are no extra steps to remove any mineral oil that may be present in the PCR solution.

    Exonuclease I/Shrimp Alkaline Phosphatase

    ExoSAP-IT is a product manufactured by USB Corporation and is an excellent method for purifying PCR reactions that produce one specific band. The Exonuclease I component functions to hydrolyze any residual single-stranded primers and any single-stranded DNA fragments produced in the PCR reaction. The Shrimp Alkaline Phosphatase degrades any excess dNTPS remaining in the reaction. The ExoSAP mixture is added directly to the PCR reaction, incubated at 37ºC for 15 minutes for hydrolysis of single-stranded DNA and dNTPS, and then incubated at 80ºC for 15 minutes to inactivate the enzymes.

    Ultrafiltration/Molecular weight cutoff columns

    Amicon Microcon and Centricon devices, which can be purchased from Millipore, are available with 30,000 and 100,000 molecular weight cut-off [MWCO] membranes and can separate primers from the synthesized PCR product. When purifying smaller PCR products (170 bp or less), choose the Centricon 30. For larger PCR products, the Centricon 100 works well. They will concentrate and desalt the DNA simultaneously, typically removing over 90% of the non-incorporated primers and dNTPs. When using either device, a small sample cup, or reservoir, is fitted into a collection tube. The reservoir contains the size-exclusion membrane at its bottom surface. The PCR product is loaded into the sample reservoir along with a suitable volume of distilled water (400 ul when using the Microcon filter, 2 ml for the Centricon), and then spun in a centrifuge. Salts, dNTPs and primers are spun through into the collection tube. To recover purified DNA, remove the sample reservoir from the vial, invert into a new tube and spin once again. The clean PCR product will then be captured in the second collection vial. Due to the increased wash volume and concentration factor, one spin in a Centricon device removes >95% of a 25 bp primer. A second spin removes up to an additional 4%. The Microcon filter will benefit from additional washes - one wash removes approximately 87% of primers, while three washes will filter away between 95%-99% of standard PCR-size primers.

    Ethanol precipitation

    If performed carefully, ethanol precipitation will yield PCR products of adequate purity for direct sequencing. However, if not done properly, residual primers and dNTPS, as well as any remaining ethanol, will give poor sequence data so be sure to remove supernatant carefully and completely, and keep your eye on the pellet.

    Both protocols listed below are for 50 ul PCR reactions, which tend to give better yields after purification, especially for larger products. For PCR reactions greater than 50 ul, proportionally scale up the reagents listed. For reactions less than 50 ul, add water to bring the volume to 50 ul. If mineral oil is present in the PCR reaction, add 100 ul of chloroform, (do not mix with PCR solution), spin at 10,000 RPM for 30 seconds and then aspirate supernatant into a clean tube. The chloroform/mineral oil component will settle to the bottom.

    • Protocol 1
      Thoroughly mix 25ul of 7.5M ammonium acetate with 190 ul 95% ethanol. Add purified supernatant (if mineral oil was previously used) or your PCR solution to this mixture. Vortex and place on ice, or at -20ºC, for 30 minutes to precipitate PCR products. Centrifuge at 10,000 RPM for 10 minutes at 4ºC. Completely remove supernatant, and dry the pellet, either by air-drying or in a vacuum centrifuge (do not overdry, a few minutes in a vacuum centrifuge will be fine). Resuspend in 20 ul of water.
    • Protocol 2
      Thoroughly mix 5 uL of 3M sodium acetate, pH 4.6, with 100 uL of 95% ethanol. Add purified supernatant or your PCR solution to this mixture. Vortex and place on ice, or at -20ºC, for 30 minutes to precipitate PCR products. Spin tubes in a microcentrifuge at maximum speed for 20 minutes. Completely remove supernatant and discard. Add 300 ul of 70% ethanol to rinse the pellet, vortex briefly, and spin for an additional 5 minutes at maximum speed. Completely remove supernatant and discard, being careful not to lose the pellet. Dry the pellet and resuspend in 50 ul water.

    Multiple PCR bands

    Gel purification

    When purifying a PCR product by gel filtration, either standard or low melting point agarose with TBE or TAE buffer may be used. However, it is important to use a high quality agarose such as FMC SeaPlaque or SeaPrep to minimize carryover of unwanted contaminants that may inhibit the sequencing reaction. When purifying the PCR band, the gel containing the PCR product of interest is first visualized under a UV light source and the band is then excised out of the agarose gel with a clean, sharp razor - minimize the amount of agarose that is cut out with the band, even if it means losing a bit of DNA. Tiny bits of agarose can have an adverse affect in the sequencing reaction. In addition, it is important to remember that UV light is damaging to your DNA - damage can occur in the time it takes you to cut out your band and it’s effect can become apparent when sequencing your DNA as you may see dramatically shortened read lengths. So whenever possible, reduce the intensity of the UV light source, reduce your exposure times or use a 366 nm UV source if available. Placing a glass plate between the light source and your gel can also help lessen the degrading effect of the UV light on your DNA. Once your band of interest has been isolated from the gel, numerous methods can be used to separate the PCR product away from the agarose slice, including the Qiaquick Gel Purification kit (MOST HIGHLY recommended), Millipore Ultrafree kit with modified TAE buffer, Promega PCR Wizard preps and Bio101 Geneclean kits. Follow the manufacturer’s direction carefully.

    PCR products should be examined and quantitated on an agarose gel AFTER gel purification as well, as you will not get 100% recovery and your assumed PCR concentration for sequencing will not be accurate.

    BAC/PAC DNA

    Considerations when cleaning up BAC/PAC DNA

    When attempting to sequence large DNA templates such as bacterial artificial chromosomes (BACs) or P1 derived artificial chromosomes (PACs), the quality of DNA template becomes even more crucial. As with plasmid DNA purification, Qiagen kits give excellent results for purification of BAC DNA for sequencing and they provide a few different methods for cleaning up the template DNA, including Qiafilter cartridges and a Large-Construct kit, the latter being somewhat more involved. One modified protocol of the Qiafilter Plasmid Midi Kit, which has consistently given good quality BAC DNA for sequencing, has been kindly provided to us from Wenjie Wu and we will post his modifications here.

    • use 100 ml of BAC culture
    • P1 buffer: add 10 ml
    • P2 buffer: add 10 ml
    • P3 buffer: add 10 ml
    • after addition of P3 buffer, incubate the sample on ice for 15 min, then centrifuge at 4000 rpm for 30 minutes at 4ºC (no incubation at room temperature).
    • add the supernatant from the centrifuged sample to the cartridge and filter the samples into a clean tube
    • apply the filtered supernatant to the Qiagen-tip for further purification and follow remaining Qiagen protocol.
    • when eluting the DNA, first warm the QF solution to 65ºC and elute 5 x 1ml to maximize yield.

    Other BAC purification methods can be used, including CsCl purification, and some other protocols are available at the following websites:

    University of Oklahoma Advanced Center for Genome Technology:
    http://www.genome.ou.edu/DblAcetateProcV3.html

    Note: BAC DNA prepped on the Autogen instrument generally does not work well for sequencing

    Methods for Quantitation

    There are three methods commonly used for quantitating DNA - spectrophotometry, agarose gel analysis and fluorometry. These methods can also give you a sense of how clean your DNA is, although none of these methods will detect everything. When using the spectrophotometer, you will typically take readings at both A260 and A280, as DNA will absorb at A260 while protein absorbs at A280. These readings will give you an A260/A280 ratio. A good DNA A260/A280 ratio should be between 1.7-1.9. If you find your ratio is smaller, this could indicate contamination of your sample with proteins or organic chemicals. If possible, use a spectrophotometer that is capable of performing a wavelength scan from 220 nm to 330 nm as a scan may be useful in revealing other contaminants such as phenol, which is detectable at 230nm, and particulates in solution that may absorb at 325nm. When calculating your DNA concentration with a spectrophotometer, you will need to know that one A260 O.D. unit (absorbance) of double-stranded DNA contains 50 ng/ul. One O.D. unit is the amount of a substance dissolved in 1 ml that gives an absorbance reading of 1.0 in a spectrophotometer with a 1-cm path length. So to calculate the concentration of DNA you have you will multiply the absorbance value times the conversion factor of 50ng/ul times any dilution factor you may have used and this will give you the concentration of your sample in ng/ul or mg/ml. However, quantitation of your DNA by spec is probably the least accurate of the three methods as both RNA and contaminating DNA will also absorb at 260nm and can potentially lead to inaccurate values. Also, readings greater than 1.0 OD or less than 0.05 are probably not very accurate, limiting the sensitivity and range of this method.

    Quantitating by agarose gel electrophoresis tends to be more accurate as you can visualize any contaminating DNA or RNA. Purified DNA should run as a single band on an agarose gel, while uncut plasmid DNA will show three bands: supercoiled, nicked and linear. This method is also useful when quantitating small amounts of DNA such as PCR products. The DNA sample is run on a gel next to a mass ladder composed of fragments of known and varying concentrations and the intensity of your DNA band is visually compared to the intensities of the bands from the mass ladder to estimate DNA concentration. When using an agarose gel, you can’t detect the presence of proteins or chemicals. To get the most information about the amount and quality of your desired DNA, both spectroscopic and gel quantitation methods should be used together.

    Perhaps the most accurate method of measurement of the three is the use of a fluorometer. Dyes may be added to the DNA such as Hoechst 33258 Dye or Picogreen which intercalate into AT rich regions of double stranded DNA and are thus quite specific to double stranded DNA, avoiding the problems of contaminating RNA seen when using a spectrophotometer. Common contaminants present in DNA preparations such as salts, urea, ethanol, chloroform, detergents, proteins and agarose do not have significant affect on these assays and thus lead to a much more sensitive and precise method for quanititation. Fluorometric measurements can detect DNA levels as low as 5 ng/ul.

    Primer design

    There are many programs on the Internet that can help you choose primers, determine potential primer-dimer formation or hairpin structures, and calculate Tm. These programs can be especially helpful when you need to design multiple sets of primers to ensure coverage of a large region of DNA. Look at our section Useful Links for some primer design programs that we have found helpful. That being said, here are some common rules for sequencing primer design:

    • primer should be 18-24 nucleotides in length - this helps ensure good and specific hybridization to the template DNA. Long primers (>35-40bp) tend not to work quite as well in sequencing due to the increased chances of secondary structure formation
    • G/C content should be approximately 50%, but the range can be 30-80%
    • Tm should be between 50º-60ºC - if your Tm is much below that it may not hybridize properly, as the annealing temperature in our cycle sequencing reaction is 50ºC. If necessary, add a few more bases to your primer to increase its Tm. To calculate the Tm of your primer use the following formula:
      • Tm = 4(G + C) + 2(A + T)º C

      As a last note on ordering primers - while purity of a primer is important, it is generally not necessary to have ultrapure primers, such as those purified by HPLC or OPC cartridge, though that is, of course, optimal. As long as the oligo synthesis efficiency was high and the majority of your primer solution contains full-length primers, then simple desalting of your primers should be fine. Primers of poor synthesis quality will not work well for sequencing because, along with your full-length product, there will be a greater proportion of "failure" primers (i.e. truncated primers of less than full length, in varying sizes) that can also act as sequencing primers. Sequence data from these primers will be poor, ranging from unusable to minor "shadow" peaks under the proper peaks. See more in our Troubleshooting section to see how to recognize this problem. When submitting custom primers for sequencing, dilute them in water to the proper concentration.

      For the do-it-yourselfers

      For those selecting the economical choice of setting up your own sequencing reactions, certain things must be taken into consideration. First, you will need to purchase the kit to perform your cycle sequencing reactions. Cycle sequencing is the method required to amplify and fluorescently label your DNA so that it can be detected on our automated sequencers. Cycle sequencing is very similar to PCR, but with two major differences. In cycle sequencing, one primer is used instead of two, thus giving linear amplification of one labeled strand. In addition, a mixture of labeled and unlabeled dNTPs are used in the reaction mix to allow for fluorescent labeling of the DNA and fragment chain termination. Read our Principles of automated fluorescent DNA sequencing section for more detailed information on the basics of cycle sequencing. Once the reactions have been set up, you will need to run them in a thermal cycler to effect the incorporation of fluorescently labeled ddNTPs and amplification of your desired DNA. Once the cycle sequencing reaction is completed, you will need to purify the reaction to remove salts, unused reactants and, most importantly, unincorporated Dye Terminator molecules. If this step is not performed carefully, these excess dye molecules will migrate along with your DNA and cause what are known as “dye blobs” which can interfere with proper basecalling of your DNA. See out Troubleshooting section for an example of a dye blob.

      With that being said, we’ve provided below our recommendations and protocols, as well as a listing of some supplies and part numbers you’ll need to get started.

      รีเอเจนต์

      Cycle sequencing reaction mixes must be purchased from Applied Biosystems, manufacturers of our sequencers. For best sequence quality and read length, we recommend the use of Big Dye Terminator chemistries, which is what we use in our sequencing reactions. Two standard chemistries are available for routine template sequencing, Big Dye Terminator v3.1 and 1.1. Part numbers are listed below:

      BigDye ® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit
      (protocol ordered separately p/n 4337035)


      Illumina DNA PCR-Free Support

      Generate end-to-end documentation tailored to your experiment.

      Library Prep and Array Kit Selector

      Determine the best kit for your project type, starting material, and method or application.

      Sequencing Coverage Calculator

      Determine reagents and sequencing runs for your desired coverage.

      การฝึกอบรม

      Maximize the effectiveness of your Illumina system, train new employees, or learn the latest techniques and best practices. We offer support webinars, online courses, expert video tips, and instructor-led trainings.

      Featured Training

      Illumina DNA PCR-Free Prep, Tagmentation

      Overview of the Illumina DNA PCR-Free Prep, Tagmentation kit and the various steps in the library preparation protocol.

      Sequencing: Fundamentals

      After completing this course you will be able to describe DNA, RNA and the central dogma discuss traditional sequencing methodologies and compare traditional sequencing to sequencing by synthesis.

      Preventing Contamination

      Best practices for minimizing PCR contamination when amplifying DNA.

      Online Community
      Join the Conversation

      The Community at Illumina can help you connect with peers and industry experts, share best practices, exchange tips and tricks, and get the support you need in easy-to-use online forums.

      MyIllumina
      Lab Management Made Simple

      Insight into your entire relationship with Illumina, at a glance. Keep up with instrument runs, product orders, support inquiries, and more through a personalized dashboard.

      Contact Us
      Technical Support
      Share With Tech Support

      Get instructions for sharing your desktop while working with Technical Support.

      Other Support
      Contact Us
      Technical Support
      [email protected]
      Other Support

      Innovative technologies

      At Illumina, our goal is to apply innovative technologies to the analysis of genetic variation and function, making studies possible that were not even imaginable just a few years ago. It is mission critical for us to deliver innovative, flexible, and scalable solutions to meet the needs of our customers. As a global company that places high value on collaborative interactions, rapid delivery of solutions, and providing the highest level of quality, we strive to meet this challenge. Illumina innovative sequencing and array technologies are fueling groundbreaking advancements in life science research, translational and consumer genomics, and molecular diagnostics.

      For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures (except as specifically noted).


      Potential Beyond Drug Discovery

      Such next-generation sequencing approaches are used by pharmaceutical companies such as Novartis, as well as many academic centers, some of them involved in cancer genome sequencing consortiums, to generate lists of genes that are frequently mutated in certain cancer types, explains Barretina. “Once you are armed with that knowledge, you can start designing drugs that will actually target those genetic alterations in particular cancers.”

      As soon as a patient is diagnosed, we should quickly determine what’s driving the cancer and use that information to select an appropriate therapy.

      Wendy Winckler, Executive Director of Next-Generation Diagnostics at Novartis Institutes for BioMedical Research

      Cataloging genetic alterations of cancer cells was one of the principal goals behind the Cancer Cell Line Encyclopedia — a massive undertaking and collaborative project between Novartis and the Broad Institute, also based in Cambridge, Mass. The encyclopedia provides genetic information on approximately 1,000 different cancer cell lines originally derived from patients’ tumors. The data is released publicly so that researchers around the world can mine it. Cell lines are easy-to-use cancer models that allow researchers to investigate cancer biology and test the effectiveness of potential drugs against various types of tumors. The Cancer Cell Line Encyclopedia also contains corresponding data detailing which cell lines respond to which drugs.

      Giordano Caponigro, one of the leaders of the Cancer Cell Line Encyclopedia collaboration, is now senior director in Oncology Translational Research at Novartis. He explains how next-generation sequencing is increasing the value of this resource. “When the Cancer Cell Line Encyclopedia started, next-generation sequencing hadn’t really hit its stride, but as it went on we realized this was an important technology,” he says. “Shortly, whole-genome sequencing of the full set of cancer cell lines will be complete, which will help with the development of highly accurate diagnostic tools and effective new cancer treatments.”


      ตัวเลือกการเข้าถึง

      เข้าถึงวารสารฉบับเต็มเป็นเวลา 1 ปี

      ราคาทั้งหมดเป็นราคาสุทธิ
      ภาษีมูลค่าเพิ่มจะถูกเพิ่มในภายหลังในการชำระเงิน
      การคำนวณภาษีจะสิ้นสุดในขั้นตอนการชำระเงิน

      รับสิทธิ์เข้าถึงบทความแบบจำกัดเวลาหรือแบบเต็มบน ReadCube

      ราคาทั้งหมดเป็นราคาสุทธิ


      V-pipe has a modular and extensible architecture. Users can design their own fully reproducible and transparent pipelines. Developers can test their own tools in a defined environment and contribute to the establishment of best practices for virus research and clinical diagnostics.

      V-pipe is freely available for download from GitHub. Further details on how to run the pipeline, as well as a test dataset, can be found on the dedicated Wiki pages of the repository, accessible through the V-pipe website’s Usage tab.

      Should you have any further question, please do not hesitate to contact us.


      New Approach to Nanopore Sequencing That Is Sure to CATCH Your Interest

      A group of scientists from Tel Aviv University recently performed an experiment utilizing Cas9-Assisted Targeting of CHromosome segments (CATCH) to isolate a gene typically associated with breast cancer, BRCA1, and used nanopore sequencing to map the gene.

      Experimental Fulcrum

      The team extracted 200kb strands of DNA from primary human peripheral blood cells—containing the 80kb BRCA1 gene and its adjacent sectors—and proceeded to process the strands with long-range amplification. Once the target sequence of 200kb was sufficiently enriched, the team began nanopore sequencing which allowed them to determine the order of nucleotides that comprised the section of interest, and even allowed for the registration of both coding and non-coding areas which may help shed light on less straightforward genetic determinants.

      Being able to extract, amplify, and analyze only 200kb rapidly expedites the ability to sequence a specific area within the human genome as compared to the massive 3 billion base pairs that make up all of our genetic information. “Due to high sequencing costs, cutting out only the region of interest from the genome focuses all your sequencing efforts and money toward this target without ‘wasting’ reads on DNA from the rest of the genome,” explains Yuval Ebenstein, Ph.D., a professor at Tel Aviv University.

      Techniques for mapping the genome are varied, including single-molecule real-time (SMRT) sequencing, nanopore sequencing, and, a little older but still relevant attributable to its higher accuracy, next-generation sequencing (NGS)—an umbrella term for technologies such as Illumina sequencing.

      However, while these methods have proven effective they are not without their limitations. NGS is hindered due to its inability to process structural aberrations greater in size than a few hundred base pairs. Long-read methods such as SMRT and nanopore sequencing are capable of detecting variations that NGS can’t, and both provide real-time viewing of data. Nanopore sequencing takes it a step further and is capable of analyzing native DNA without the need for PCR amplification techniques—which all other sequencing methods depend on. The elimination of prerequisite amplification is a huge advantage because it is often during PCR amplification that more errors and single nucleotide polymorphisms (SNPs) are produced. With that said, nanopore sequencing still has a ways to go in terms of achieving greater accuracy, while NGS has shown itself to be tried and true.

      Dr. Ebenstein points out that while nanopore sequencing is normally able to make use of native DNA, “CATCH isolates only a tiny fraction of the genome which means that very low amounts of DNA are recovered for library preparation. Currently, this implies that the DNA must either be isolated from a very large amount of cells or amplified to achieve the needed amount of material for sequencing.”


      CATCH nanopore sequencing promises to increase our genome mapping capabilities. [Tel Aviv University]

      Finance, Function, and Future

      ทั้งหมดนี้หมายความว่าอย่างไร NGS is incapable of processing reads bigger than a few hundred base pairs, while nanopore technology is capable of processing reads up to several kilo base pairs. However, an intrinsic obstacle to nanopore sequencing is that it can be expensive. It’s true that the upfront cost for Oxford Nanopore Technologies’ MinION retails for only $1,000, but while “the initial capital investment is indeed lower, the price per base on the MinION is still considerably higher than NGS,” notes Dr. Ebenstein, “although [nanopore sequencing] can obtain information that is inaccessible to NGS.”

      By utilizing CATCH, scientists can isolate and enrich smaller portions of the genome, as done in this experiment, by having the Cas9 cut at the sequence of interest’s flanking regions. It is possible to expedite the process, as nanopore sequencing can be used only on the cut-out region of interest rather than the entire genome. That was one of the crucial points that the team wanted to convey with this experiment.

      “CATCH brings nanopore sequencing closer to the clinic by offering targeted, cost-effective sequencing,” explains Dr. Ebenstein. “You only need sequence knowledge for two regions flanking your target, thus enabling the enrichment of large variable regions in the genome that are very complex and challenging for conventional approaches.”

      This is cause for excitement as CATCH furthers the potential of an already impressive technique for DNA sequencing. Nanopore sequencing is already highly valued for its ultra-long reads and real-time analysis capability, but with the incorporation of CATCH the entire process can occur even faster and with greater fiscal efficacy.

      “The long reads provided by nanopore sequencing allow for the characterization of structural variations in conjunction with smaller aberrations such as SNPs. Together, this information is critical for understanding the genetic causes of disease,” states Dr. Ebenstein.

      The results of the experiment were telling as to the capabilities and limitations of both NGS and nanopore sequencing. In their paper, published in การวิจัยกรดนิวคลีอิก as “Selective nanopore sequencing of human BRCA1 by Cas9-assisted targeting of chromosome segments (CATCH)”, the team shared data that “NGS discovered 177 SNPs. Nanopore data revealed 62% of the SNPs with only two SNPs not present at all in the nanopore data and the remaining 37% inconclusive.”

      “NGS has a lower error rate compared to nanopore. Therefore, it is more qualified to detect single base mutations,” says Dr. Ebenstein. “On the other hand, sufficient coverage (offered by CATCH) can overcome these errors by averaging over many reads. In addition, nanopore has better access to larger aberrations such as structural and copy number variants.”

      Yael Michaeli, Ph.D., School of Chemistry, Faculty of Exact Sciences at Tel Aviv University, mentions that their team “used a software that is more compatible with NGS reads and this in part may explain the inferior results of the nanopore.”

      It’s clear that there are still some areas of uncertainty surrounding nanopore sequencing and compared to the competition it still has to prove itself a little further in terms of reliability. Still, Dr. Ebenstein believes that “by now it seems quite clear that nanopore sequencing will find its place in routine genomic analysis pipelines. [However,] it is still more expensive than NGS, and should be chosen only when needed.”


      Next-Generation Sequencing (NGS)

      Next-generation sequencing (NGS) is a massively parallel sequencing technology that offers ultra-high throughput, scalability, and speed. The technology is used to determine the order of nucleotides in entire genomes or targeted regions of DNA or RNA. NGS has revolutionized the biological sciences, allowing labs to perform a wide variety of applications and study biological systems at a level never before possible.

      Today's complex genomics questions demand a depth of information beyond the capacity of traditional DNA sequencing technologies. NGS has filled that gap and become an everyday tool to address these questions.

      Next-Generation Sequencing for Beginners

      We'll guide you through the basics of NGS, with tutorials and tips for planning your first experiment.

      See What NGS Can Do For You

      NGS technology has fundamentally changed the kinds of questions scientists can ask and answer. Innovative sample preparation and data analysis options enable a broad range of applications. For example, NGS allows labs to:

      • Rapidly sequence whole genomes
      • Deeply sequence target regions
      • Utilize RNA sequencing (RNA-Seq) to discover novel RNA variants and splice sites, or quantify mRNAs for gene expression analysis
      • Analyze epigenetic factors such as genome-wide DNA methylation and DNA-protein interactions
      • Sequence cancer samples to study rare somatic variants, tumor subclones, and more
      • Study the human microbiome
      • Identify novel pathogens

      Accessible Whole-Genome Sequencing

      Using capillary electrophoresis-based Sanger sequencing, the Human Genome Project took over 10 years and cost nearly $3 billion.

      Next-generation sequencing, in contrast, makes large-scale whole-genome sequencing (WGS) accessible and practical for the average researcher. It enables scientists to analyze the entire human genome in a single sequencing experiment, or sequence thousands to tens of thousands of genomes in one year.

      NGS Data Analysis Tools

      Explore user-friendly tools designed to make data analysis accessible to any scientist, regardless of bioinformatics experience.

      Broad Dynamic Range for Expression Profiling

      NGS-based RNA-Seq is a powerful method that enables researchers to break through the inefficiency and expense of legacy technologies such as microarrays. Microarray gene expression measurement is limited by noise at the low end and signal saturation at the high end.

      In contrast, next-gen sequencing quantifies discrete, digital sequencing read counts, offering a broader dynamic range. 1,2,3

      Tunable Resolution for Targeted NGS

      Targeted sequencing allows you to sequence a subset of genes or specific genomic regions of interest, efficiently and cost-effectively focusing the power of NGS. NGS is highly scalable, allowing you to tune the level of resolution to meet experimental needs. Choose whether to do a shallow scan across multiple samples, or sequence at greater depth with fewer samples to find rare variants in a given region.

      NGS for COVID-19

      Next-generation sequencing is uniquely positioned in an infectious disease surveillance and outbreak model. Learn which NGS methods are recommended for detecting and characterizing SARS-CoV-2 and other respiratory pathogens, tracking transmission, studying co-infection, and investigating viral evolution.

      How Does Illumina NGS Work?

      Illumina sequencing utilizes a fundamentally different approach from the classic Sanger chain-termination method. It leverages sequencing by synthesis (SBS) technology – tracking the addition of labeled nucleotides as the DNA chain is copied – in a massively parallel fashion.

      Next-generation sequencing generates masses of DNA sequencing data, and is both less expensive and less time-consuming than traditional Sanger sequencing. 2 Illumina sequencing systems can deliver data output ranging from 300 kilobases up to multiple terabases in a single run, depending on instrument type and configuration.

      Sequencing Technology Video

      In-Depth NGS Introduction

      This detailed overview of Illumina sequencing describes the evolution of genomic science, major advances in sequencing technology, key methods, the basics of Illumina sequencing chemistry, and more.

      What Can You Do with Next-Generation Sequencing?

      See how scientists utilize NGS to make breakthrough discoveries.
      Genetics of COVID-19 Susceptibility

      This UK-wide study uses NGS to compare the genomes of severely and mildly ill COVID-19 patients, to help uncover genetic factors associated with susceptibility.

      Exploring the Tumor Microenvironment

      Researchers use single-cell techniques to study cancer microenvironments, to elucidate gene expression patterns and gain insights into drug resistance and metastasis.

      Using NGS to Study Rare Diseases

      Whole-exome and transcriptome sequencing prove beneficial in uncovering mutations and pathways associated with rare genetic diseases.

      Evolution of Illumina NGS

      Recent Illumina next-generation sequencing technology breakthroughs include:

        : The iSeq 100 System combines a complementary metal-oxide semiconductor (CMOS) chip with one-channel SBS to deliver high-accuracy data in a compact system. : This technology enables faster sequencing than the original 4-channel version of SBS technology, with the same high data accuracy. : This option offers an exceptional level of throughput for diverse sequencing applications. : Learn how the NovaSeq 6000 System offers tunable output of up to 6 Tb in

      History of Illumina Sequencing

      Find out how Illumina SBS technology originated and evolved over time.

      Bring NGS to Your Lab

      The resources below offer valuable guidance to scientists who are considering purchasing a next-generation sequencing system.

      Download Buyer’s Guide

      NGS Experimental Considerations

      Learn about read length, coverage, quality scores, and other experimental considerations to help you plan your sequencing run.

      Use our interactive tools to help you create a custom NGS protocol or select the right products and methods for your project.

      Key Terms in NGS

      Use our next-generation sequencing glossary to clarify key terms and important concepts as you plan your sequencing project.

      Methods Guide

      Access the information you need—from BeadChips to library preparation for genome, transcriptome, or epigenome studies to sequencer selection, analysis, and support—all in one place. Select the best tools for your lab with our comprehensive guide designed specifically for research applications.

      Genomics News

      Illumina and Next Generation Genomic Launch Expanded NIPT in Thailand

      The collaboration will introduce VeriSeq™ NIPT Solution v2 in Southeast Asia

      Using Analytics to Improve Cancer Diagnosis and Therapy Selection

      Developing and automating best-practice workflows that make analyzing, processing, and disseminating genomic data accessible to researchers and clinicians.

      China’s Novogene is a Global Force

      The NGS services provider has completed 1.2 million samples—and they’re just getting started

      Interested in receiving newsletters, case studies, and information from Illumina based on your area of interest? สมัครเลย.

      Related Solutions

      NGS Library Preparation

      Fast, simple NGS library prep and enrichment workflows from Illumina to prepare your samples for sequencing.

      Sequencing Services

      Access fast, reliable next-generation sequencing services that provide high-quality data and offer extensive scientific expertise.

      Illumina NGS & Microarray Training

      Work with expert Illumina instructors and get hands-on training. We also offer online courses, webinars, videos, and podcasts.

      อ้างอิง
      1. Wang Z, Gerstein M, Snyder M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. แนท เรฟ เจเนท. 200910:57–63.
      2. Wilhelm BT, Landry JR. RNA-Seq—quantitative measurement of expression through massively parallel RNA sequencing. วิธีการ 200948:249–57.
      3. Zhao S, Fung-Leung WP, Bittner A, and Ngo K, Liu X. Comparison of RNA-Seq and microarray in transcriptome profiling of activated T cells. ป.ล. หนึ่ง 2014169(1):e78644.

      Innovative technologies

      At Illumina, our goal is to apply innovative technologies to the analysis of genetic variation and function, making studies possible that were not even imaginable just a few years ago. It is mission critical for us to deliver innovative, flexible, and scalable solutions to meet the needs of our customers. As a global company that places high value on collaborative interactions, rapid delivery of solutions, and providing the highest level of quality, we strive to meet this challenge. Illumina innovative sequencing and array technologies are fueling groundbreaking advancements in life science research, translational and consumer genomics, and molecular diagnostics.

      For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures (except as specifically noted).


      บทนำ

      Initial sequencing of the human genome took more than a decade and cost an estimated $70 million dollars (1). Sequencing for the Human Genome Project (HGP) relied primarily on automation of sequencing methods first introduced by Sanger in 1977 (2). Despite the successful use this technology to generate early maps of the human genome (3–5), the limitations of Sanger sequencing created a high demand for more robust sequencing technologies capable of generating large amounts of data, quickly, and at lower costs.

      Recognizing this need, the National Human Genome Research Institute (NHGRI) initiated a funding program in 2004 aimed at catalyzing sequencing technology development and with a goal of reducing the cost of genome sequencing to ∼$100,000 in 5 years and, ultimately, $1,000 in 10 years (6–8). The initiative has been widely successful to date, and a bevy of new technologies has emerged in the sequencing marketplace over the past 5 years. New technologies offer radically different approaches that enable the sequencing of large amounts of DNA in parallel and at substantially lower costs than conventional methods. เงื่อนไข "next-generation sequencing" และ "massive-parallel sequencing” have been used loosely to collectively refer to these new high-throughput technologies.


      บทสรุป

      This study has proved that RNA ligases derived from T4-phage exhibit significant sequence specificity in their activity. The profiles of small RNAs are strongly dependent on the adapters used for sample preparation. In light of this, the current, popular, sRNA-seq protocols need revision. We find that a mix of adapters, with different sequence ends, permits a more accurate estimation of the amounts of individual miRNA sequences and their isoforms. The use of RNA ligases in other protocols, such as oligoribonucleotide circularization ( 38), should be reviewed for possible effects of the bias discussed in this study.