ข้อมูล

ความถูกต้องของการวัดการหายใจในไมโตคอนเดรียที่แยกได้

ความถูกต้องของการวัดการหายใจในไมโตคอนเดรียที่แยกได้



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

ฉันได้อ่านบทความเกี่ยวกับการออกกำลังกายและไมโตคอนเดรียสองสามฉบับเมื่อเร็วๆ นี้ ซึ่งในสถานะ 4 และ 3 อัตราการหายใจและการผลิต ROS ได้รับการประเมินในหลอดทดลองหลังจากออกกำลังกาย (เช่น ไมโทคอนเดรียหัวใจของหนูถูกแยกออก)


คำถาม:

เนื่องจากต้องใช้เวลา 1 ชั่วโมงในการกำจัดไมโตคอนเดรียออกจากสัตว์และแยกออก ซับสเตรตเพิ่มเติม (อิ่มตัว) จะถูกเพิ่มเข้าไปก่อนที่จะวัดพารามิเตอร์การหายใจ และสื่อนั้นอิ่มตัวจนถึงความเข้มข้นของออกซิเจนแวดล้อม (สูงกว่าในร่างกายมาก) การทดลองประเภทนี้ใช้ได้กับการประเมินการทำงานของไมโตคอนเดรีย ในร่างกาย ในสัตว์ที่เคลื่อนไหวหรือไม่? ความคิดเห็นและ/หรือตัวชี้ไปยังแหล่งข้อมูลที่อธิบายว่าการวัดเหล่านี้จะมีประโยชน์เพียงใด


การประเมินการหายใจด้วยอิเล็กโทรดชนิดคลาร์กในไมโตคอนเดรียที่แยกได้และเซลล์สัตว์ที่ดูดซึมได้

ในการศึกษาจำนวนมาก การประเมินการทำงานของไมโตคอนเดรียมีความสำคัญอย่างยิ่งต่อการทำความเข้าใจว่าสภาวะของโรคหรือซีโนไบโอติกเปลี่ยนแปลงการทำงานของไมโตคอนเดรียอย่างไร จุดสิ้นสุดแบบคลาสสิกจุดหนึ่งที่สามารถประเมินได้คือการใช้ออกซิเจน ซึ่งสามารถทำได้ภายใต้สภาวะควบคุมแต่ยังสร้างขึ้น ออกซิเจนเป็นตัวรับปลายทางในห่วงโซ่ทางเดินหายใจของไมโตคอนเดรีย กล่าวคือ ที่เอนไซม์ที่เรียกว่าไซโตโครมออกซิเดส ซึ่งผลิตน้ำในกระบวนการและปั๊มโปรตอนจากเมทริกซ์ไปยังช่องว่างระหว่างเยื่อหุ้มเซลล์ มีเทคนิคมากมายในการวัดปริมาณการใช้ออกซิเจน ซึ่งรวมถึงโพลาโรกราฟีด้วยอิเล็กโทรดออกซิเจนหรือโพรบฟลูออเรสเซนต์/เรืองแสง บทปัจจุบันจะกล่าวถึงการกำหนดปริมาณการใช้ออกซิเจนในไมโตคอนเดรียโดยใช้อิเล็กโทรดประเภทคลาร์กซึ่งใช้กันอย่างแพร่หลายในวรรณคดีและยังคงเป็นเทคนิคที่เชื่อถือได้ เราเน้นรายละเอียดทางเทคนิคของเราในการวัดปริมาณการใช้ออกซิเจนโดยแยกส่วนไมโตคอนเดรียและโดยเซลล์ที่ซึมผ่านได้

คำสำคัญ: อัตราส่วน ADP/O การหายใจระดับเซลล์ อิเล็กโทรดชนิดคลาร์ก ไมโตคอนเดรีย ไมโตคอนเดรีย ห่วงโซ่การหายใจ อัตราการใช้ออกซิเจน เซลล์ที่ซึมผ่านได้ อัตราส่วนการควบคุมการหายใจ


เชิงนามธรรม

การประเมินกิจกรรมของไมโตคอนเดรียในหัวใจน่าจะเป็นวิธีที่ดีที่สุดในการประมาณความเสียหายของเซลล์ในระยะเริ่มต้นในพยาธิสภาพเรื้อรัง การวินิจฉัยตั้งแต่เนิ่นๆ ช่วยให้สามารถรักษาได้อย่างรวดเร็ว ซึ่งจะเป็นการเพิ่มอัตราการรอดชีวิตของผู้ป่วยในหลายโรค อย่างไรก็ตาม ข้อมูลเกี่ยวกับไมโตคอนเดรียหัวใจของมนุษย์นั้นหายากในวรรณคดีระหว่างประเทศ ในที่นี้ เราอธิบายวิธีการสกัดและศึกษาไมโตคอนเดรียที่ใช้งานได้จากส่วนลงตัวของหัวใจห้องบนขวาขนาดเล็ก (ขั้นต่ำ 400 มก.) ที่ได้รับระหว่างการไหลเวียนนอกร่างกาย และโดยปกติถือว่าเป็นของเสียจากการผ่าตัด ไมโทคอนเดรียถูกทำให้บริสุทธิ์ผ่านกระบวนการทางกลหลายอย่าง (การตัดกล้ามเนื้อหัวใจแบบละเอียด การบดเนื้อเยื่อ และการทำให้เป็นเนื้อเดียวกันของพอตเตอร์ Elvehjem) การออกฤทธิ์ของเอนไซม์สลายโปรตีน (ซับติลิซิน) และการหมุนเหวี่ยงแยกส่วน ในโรคเรื้อรังรวมถึงโรคอ้วนอาจเกิดการรบกวนการทำงานของไมโตคอนเดรียในระยะเริ่มต้น ผลของโรคอ้วนต่ออัตราการบริโภคออกซิเจนในไมโตคอนเดรียและ H2โอ2 ดังนั้นการปลดปล่อยจึงถูกกำหนดหาด้วยซับสเตรตที่แตกต่างกันสามแบบ (กลูตาเมต/มาเลต, ซัคซิเนต/โรทีโนนและพาลมิโตอิลคาร์นิทีน/มาเลต) ไมโตคอนเดรีย atrial ของมนุษย์มีคุณภาพสูงจากมุมมองการทำงาน เมื่อเทียบกับออร์แกเนลล์ของโพรงในหนู แต่ผลผลิตการสกัดของไมโตคอนเดรียของมนุษย์นั้นต่ำกว่าไมโตคอนเดรียของหนูสองเท่า การทดสอบแสดงให้เห็นว่าการหายใจที่กระตุ้นด้วย ADP ที่เกี่ยวข้องกับกลูตาเมต/มาเลตเพิ่มขึ้นอย่างมากในกลุ่มคนอ้วน แม้ว่าการเกิดออกซิเดชันของอีกสองพื้นผิวจะไม่ได้รับผลกระทบ การผลิตออกซิเจนแบบรีแอกทีฟ (ROS) โดยไมโตคอนเดรียที่แยกได้นั้นต่ำเมื่อเปรียบเทียบกับของแบบลีน ผลลัพธ์เหล่านี้ยืนยันสิ่งที่พบในการศึกษาก่อนหน้านี้ของเราในโพรงของหนูที่เลี้ยงด้วยอาหารที่มีไขมันสูง โดยสรุป วิธีการที่อธิบายไว้นั้นง่าย เชื่อถือได้ และละเอียดอ่อน ช่วยให้สามารถอธิบายผลกระทบของโรคอ้วนต่อการทำงานของ atrial mitochondria ในขณะที่ใช้การสุ่มตัวอย่างผู้ป่วยเพียงเล็กน้อย (n = 5 ในกลุ่มคนอ้วนและกลุ่มอ้วน)


ผลลัพธ์และการอภิปราย

โปรโตคอลที่อธิบายในที่นี้กำหนดอัตราการหายใจของยลของเนื้อเยื่อเหงือกที่ซึมผ่านจากปลาได้สำเร็จ (ตารางที่ 1 รูปที่ 2A) โปรไฟล์การหายใจที่ได้รับโดยใช้เทคนิคนี้แสดงให้เห็นถึงการเพิ่มขึ้นของ O2 อัตราการบริโภคในแต่ละขั้นตอนเมื่อสารตั้งต้น pyruvate, malate, glutamate และ succinate ถูกเติมตามลำดับเพื่อกระตุ้นส่วนประกอบในห่วงโซ่การขนส่งอิเล็กตรอน และตอบสนองในลักษณะที่คาดไว้ต่อสารยับยั้ง mitochondrial complex inhibitors ที่รู้จัก ได้แก่ oligomycin และ antimycin A (รูปที่ 2A) การเพิ่มไซโตโครม ทำให้อัตราการหายใจเพิ่มขึ้นเพียงเล็กน้อย (ตารางที่ 1) ซึ่งยืนยันว่ายามีคุณภาพสูง เมื่อเปรียบเทียบกับเนื้อเยื่อเหงือกกึ่งแยกกึ่ง Dounce-homogenized (Braz-Mota et al., 2018) การเตรียมของเราแสดงค่า RCR ที่สูงกว่า (7.4 เทียบกับ 2.6–5.5) ซึ่งยืนยันเพิ่มเติมถึงคุณภาพของการเตรียมไมโตคอนเดรียโดยใช้เทคนิคนี้ ( ตารางที่ 1). เป็นที่น่าสนใจที่จะสังเกตว่าค่าการหายใจของเราต่ำกว่าที่รายงานโดย Braz-Mota et al (2018) แม้ว่าจะเป็นที่คาดหมายและแสดงให้เห็นในการศึกษาเปรียบเทียบการเตรียมไมโตคอนเดรียที่แตกต่างกันในกลุ่มแท็กซ่าอื่น (Saks et al., 1998 Picard et al., 2011 Mahalingam et al., 2017) อัตราการหายใจของไมโตคอนเดรียได้รับการทำให้เป็นมาตรฐานแบบคลาสสิกโดยใช้เครื่องหมายของปริมาตรของไมโตคอนเดรีย ซึ่งรวมถึงกิจกรรม CS และ COX (Barrientos, 2002 Larsen et al., 2012 Dawson et al., 2018) และอัตราการหายใจของยลของเราแสดงความสัมพันธ์เชิงเส้นที่ดีเยี่ยม (NS=0.011, NS 2 =0.689 รูปที่ 2B) กับกิจกรรม CS ซึ่งบ่งชี้ว่าการวัดของเราเป็นผลมาจากการใช้ออกซิเจนที่มีไมโตคอนเดรีย ซึ่งสอดคล้องกับการทดลองก่อนหน้านี้ที่แสดงความสัมพันธ์ที่ชัดเจนระหว่างเนื้อหาของไมโตคอนเดรียกับกิจกรรม CS (Larsen et al., 2012) ในขณะที่เสนและคณะ (2012) ยังพบความสัมพันธ์เชิงเส้นตรงระหว่างเนื้อหาของไมโตคอนเดรียกับกิจกรรม COX ความสัมพันธ์นี้ไม่มีนัยสำคัญในการศึกษาของเรา (NS=0.079, NS 2 =0.426 รูปที่ 2C) แต่ขนาดตัวอย่างเล็ก (NS=8) หมายความว่าพลังทางสถิติต่ำ เนื่องจากการวัดค่าที่ง่ายกว่าและความสัมพันธ์ที่แน่นแฟ้นกับอัตราการหายใจ เราขอแนะนำว่า CS เป็นวิธีที่เหมาะสมกว่าและเข้าถึงได้ง่ายกว่าในการทำให้อัตราการหายใจของไมโตคอนเดรียในเหงือกเป็นปกติ

พารามิเตอร์ของไมโตคอนเดรียจากการวัดซ้ำของเหงือกที่ผ่านการซึมผ่านของเหงือกในปลาเทราต์สีน้ำตาล


เชิงนามธรรม

สัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมที่จำศีลอาจระงับอัตราการเผาผลาญพื้นฐานในช่วงอาการกระตุกได้ถึง 95% เพื่อลดการใช้พลังงานในช่วงฤดูหนาว แต่กลไกพื้นฐานยังคงไม่ค่อยเข้าใจ เราแสดงให้เห็นว่าไฮโดรเจนซัลไฟด์ (H2S) ซึ่งเป็นโมเลกุลส่งสัญญาณที่แพร่หลาย เป็นตัวยับยั้งการหายใจของไมโตคอนเดรียในตับที่แยกได้จากกระรอกดิน 13 ตัวที่ร่าเริง แต่มีผลเล็กน้อยต่อไมโตคอนเดรียที่แยกได้ในช่วงฤดูร้อนและการตื่นนอน ซึ่งอัตราการเผาผลาญเป็นปกติ สอดคล้องกับสิ่งเหล่านี้ ในหลอดทดลอง ผลกระทบ เราพบรูปแบบตามฤดูกาลที่แข็งแกร่งของ ในร่างกาย ระดับของ H2S ในพลาสมาและการเพิ่มขึ้นของH2ระดับ S ในตับของกระรอกในช่วงอาการมึนงง เมื่อเทียบกับระดับในช่วงตื่นตัวและฤดูร้อน NS ในร่างกาย การเปลี่ยนแปลงของตับ H2ระดับ S สอดคล้องกับกิจกรรมที่ต่ำของไมโตคอนเดรีย H2เอส ออกซิไดซ์ เอนไซม์ ซัลไฟด์:ควิโนน ออกซิโดเรดัคเตส (SQR) ในระหว่างการบิดงอ เมื่อนำมารวมกันแล้ว ผลลัพธ์เหล่านี้บ่งชี้ว่าในช่วงอาการมึนงง H2S สะสมในตับเนื่องจากกิจกรรม SQR ต่ำและมีส่วนช่วยในการยับยั้งการหายใจของไมโตคอนเดรีย ในขณะที่ในช่วงที่ตื่นตัวและฤดูร้อน ผลกระทบเหล่านี้จะกลับกัน H2S ลดลงโดย SQR ที่ใช้งานอยู่และอัตราการหายใจของไมโตคอนเดรียเพิ่มขึ้น การศึกษานี้ให้ข้อมูลเชิงลึกที่แปลกใหม่เกี่ยวกับกลไกการจำศีลของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม โดยชี้ไปที่ SQR เป็นเอนไซม์สำคัญที่เกี่ยวข้องกับการควบคุมการทำงานของไมโตคอนเดรีย


4. การอภิปราย

การเลือกคราบที่เหมาะสมเพื่อใช้ในแผงโฟลว์ไซโตเมทรีเพื่อวัดการทำงานของไมโตคอนเดรียเป็นสิ่งสำคัญในความพยายามของทุกคนในการให้ข้อมูลที่มีความหมายและลึกซึ้ง ข้อมูลของเรายืนยันว่า MTG และ NAO แปลเป็นไมโทคอนเดรียโดยไม่ขึ้นกับ ΔΨNS. อย่างไรก็ตาม MTG ไม่ได้ให้การวัดมวลไมโตคอนเดรียที่แม่นยำในทุกสภาวะ ในการศึกษาเซลล์ทั้งหมดของเรา เราสังเกตเห็นความสัมพันธ์กับ MTG MFI และเครื่องหมายของเราสำหรับความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันของเซลล์และไมโตคอนเดรีย เป็นไปได้ว่า MTG อาจทำหน้าที่เป็นสารตั้งต้นสำหรับการลดโปรตีนไมโตคอนเดรียที่ออกซิไดซ์ เช่น เพอรอกซิเรดอกซิน ไทโอเรดอกซิน หรือกลูตาเรดอกซิน และการเพิ่มขึ้นของ MTG เรืองแสงที่เราตรวจพบอาจเกิดจากหนึ่งในสองกลไก: (1) ออกซิเดชันโดยซีสเตอีนในไมโตคอนเดรีย โปรตีนหรือ (2) ROS ที่เกิดจากห่วงโซ่การขนส่งอิเล็กตรอน (ETC) กลไกเหล่านี้อาจเป็นคำอธิบายที่เป็นไปได้ว่าทำไมคนอื่นจึงรายงานสัญญาณ MTG ที่เพิ่มขึ้นหลังจากการเปลี่ยนแปลงการทำงานของไมโตคอนเดรีย โดยไม่ขึ้นกับว่าสารประกอบนั้นเพิ่มหรือกระจาย ΔΨNS [5]. การรักษาหลายอย่างเหล่านี้ยังเปลี่ยนแปลงสภาพแวดล้อมรีดอกซ์และอาจส่งผลต่อการเรืองแสงของ MTG ข้อมูลของเราแสดงให้เห็นว่าการรักษาเพียงอย่างเดียวที่ไม่ส่งผลให้มวลไมโตคอนเดรียเปลี่ยนแปลงอย่างมีนัยสำคัญโดย MTG คือตัวรีดิวซ์ NAC การรักษาด้วย NAC ทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงเล็กน้อยในระดับ ROS และ RNS ในไมโตคอนเดรียหลังจาก 2 ชั่วโมง (รูปที่ 1a) การย้อมสีไมโตคอนเดรียในเซลล์ทั้งหมดด้วย NAO ซึ่งจับกับคาร์ดิโอลิพิน แสดงให้เห็นว่าการเรืองแสงลดลงในตัวอย่างที่รักษาด้วย NO แม้ว่าการวิเคราะห์สหสัมพันธ์ของเราทั้ง DAF-FM และ DHR (เครื่องหมายสำหรับ NO และ RNS) ไม่ได้ระบุถึงความสำคัญใดๆ ก็ตาม แต่ก็แสดงแนวโน้มเชิงลบ นี่อาจเป็นเพราะการออกซิเดชันของคาร์ดิโอลิพินโดยเปอร์ออกซีไนไตรต์ [8] ส่งผลให้ตำแหน่งจับของ NAO ลดลง

เมื่อเราแยกไมโทคอนเดรียหลังการรักษา เราไม่เห็นการเปลี่ยนแปลงของมวลไมโตคอนเดรียโดย FSC แม้ว่าจะมีการเปลี่ยนแปลงจำนวนมากจากการย้อมสี MTG ของทั้งเซลล์ก็ตาม การขาดการเปลี่ยนแปลงของมวลโดย FSC แต่การย้อมสี MTG ที่เพิ่มขึ้นอาจเป็นผลมาจากการสร้างชีวภาพของไมโตคอนเดรียควบคู่ไปกับการแยกตัวของไมโตคอนเดรีย อย่างไรก็ตาม การขาดการเปลี่ยนแปลงระดับโปรตีนในไมโตคอนเดรียที่วัดได้โดยใช้ Western blotting แสดงให้เห็นว่าไม่เป็นเช่นนั้น เมื่อเราเปรียบเทียบการวัดมวลของไมโตคอนเดรียในเซลล์ทั้งหมดกับผลลัพธ์ Western blot ของเรา เราจะสังเกตการวัดมวลของ NAO ที่ใกล้เคียงกับการเปลี่ยนแปลงที่เห็นในระดับโปรตีนโดย western blotting โดยให้หลักฐานว่า NAO เป็นตัวบ่งชี้มวลที่แม่นยำกว่า MTG

ในขณะที่การวิเคราะห์เซลล์ทั้งหมดแสดงให้เห็นการเปลี่ยนแปลงอย่างมากในการเรืองแสงของ MTG ไมโทคอนเดรียที่แยกได้มีการเปลี่ยนแปลงสัญญาณ NAO มากขึ้น สิ่งนี้ชี้ให้เห็นว่า NAO ในขณะที่เซลล์ซึมผ่านได้นั้นไม่ตอบสนองแบบเดียวกันในเซลล์ทั้งหมดเหมือนกับที่ทำในไมโตคอนเดรียที่แยกได้ หรือคาร์ดิโอลิพินนั้นอาจเปิดเผยมากขึ้นอันเป็นผลมาจากโปรโตคอลการแยกของเรา ความคลาดเคลื่อนเหล่านี้ควรนำมาพิจารณาเมื่อเลือกสีย้อมมวลไมโตคอนเดรียเพื่อการศึกษา

การวิเคราะห์โฟลว์ไซโตเมตริกของไมโตคอนเดรียที่แยกได้ของเราระบุประชากรย่อยสองกลุ่มที่ย้อมเป็นบวกอย่างมากด้วยทั้ง MTG และ NAO แต่มีสัญญาณ TMRM น้อยที่สุด ประชากรทั้งสองนี้มีความสอดคล้องกันในตำแหน่งของพวกเขาภายในแปลงไปข้างหน้าเทียบกับการกระจัดกระจายด้านข้างระหว่างกลุ่มการรักษาแต่ละกลุ่ม ( รูปที่ 2 ) ประชากรไมโตคอนเดรียทั้งสองนี้อาจมาจากกลุ่มย่อยที่แตกต่างกันของเซลล์ภายใน PBL ที่แยกได้ ด้วยเซลล์ประเภทต่าง ๆ ที่มีความต้องการภาระงานที่แตกต่างกัน โครงสร้างไมโตคอนเดรียในแต่ละชุดย่อยจะแตกต่างกัน และอาจอธิบายได้ว่าทำไมเราจึงเห็นกลุ่มที่แตกต่างกันเหล่านี้ การใช้ประชากรเซลล์ที่แยกได้จาก PBL อาจช่วยอธิบายได้ว่าประชากรเหล่านี้มาจากที่ใด

การลดลงอย่างมีนัยสำคัญของระดับโปรตีน NDUFS3 ถูกวัดโดย western blot หลังจากการบำบัด 15 นาทีด้วย NAC 3 มิลลิโมลาร์ การลดลงนี้ไม่มีอยู่ในตัวอย่างที่บำบัด 2 ชั่วโมงของเรา เมื่อไม่พบความแตกต่างในระดับของโปรตีนเยื่อหุ้มไมโตคอนเดรียชั้นนอก VDAC หรือโปรตีนเยื่อหุ้มไมโตคอนเดรียชั้นใน ANT หลังการรักษาด้วย NAC เราขอเสนอว่าอาจมีปฏิสัมพันธ์เฉพาะระหว่าง NAC และคอมเพล็กซ์ I เนื่องจากเราได้อธิบายการหายใจที่ซับซ้อน I ก่อนหน้านี้ ถูกยับยั้งโดย NAC โดยตรง [9] การลดลงนี้อาจเป็นผลมาจากการยับยั้งคอมเพล็กซ์ I ของ NAC กลไกหนึ่งที่เป็นไปได้ที่อาจเกิดขึ้นได้คือความสามารถของ NAC ในการทำลายพันธะไดซัลไฟด์ [10] ซึ่งนำไปสู่การสูญเสียโปรตีนคอมเพล็กซ์ I บางชนิด จำเป็นต้องมีการทำงานเพิ่มเติมเพื่อสำรวจสมมติฐานนี้

ในการศึกษานี้ เราได้ให้หลักฐานว่า MTG ไม่ได้วัดมวลไมโตคอนเดรียอย่างแม่นยำในทุกสภาวะ และสิ่งนี้ไม่ได้เกิดจากการเปลี่ยนแปลงใน ΔΨNSแต่เป็นผลจากการเปลี่ยนแปลงความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันและไนโตรเซทีฟ แม้ว่าทั้ง MTG และ NAO อาจเป็นตัวบ่งชี้ที่ดีสำหรับมวลไมโตคอนเดรียภายใต้สภาวะทางสรีรวิทยา แต่เราเชื่อว่าจำเป็นต้องเข้าใจสถานะ ROS และ RNS ของไมโตคอนเดรียก่อนที่จะใช้สีย้อมเหล่านี้เพื่อกำหนดมวลยลโดยโฟลว์ไซโตเมทรี


ผลลัพธ์

การตรวจสอบความถูกต้องของขั้นตอนการทดสอบด้วยสเปกโตรโฟโตเมตริก

ไม่พบโปรตีนเฟอริกที่ตรวจพบเมื่อมีซูเปอร์ออกไซด์ดิสมิวเตสและคาตาเลส การทดลองควบคุมให้ผลลัพธ์ที่เหมือนกันไม่ว่าปริมาณคิวเวตต์จะถูกกวนผสมในคิวเวตต์ที่เติมอย่างสมบูรณ์โดยไม่มีเฟสของแก๊สหรือไม่ในการทดลองควบคุมเหล่านี้ ดังนั้น เนื้อหาของ cuvette ของ Thunberg จึงไม่ถูกกวนในการทดลองที่รายงานที่นี่ การแลกเปลี่ยนวัสดุระหว่างเฟสของแก๊สและสารละลายในน้ำในส่วนล่างของคิวเวตต์ที่ลำแสงส่องผ่านนั้นช้ามาก การทดลองควบคุมระบุว่าอาจถูกละเลยในการทดลองสั้นๆ เหล่านี้ ไมโตคอนเดรียจะค่อยๆ ตกตะกอน ดังนั้นจำนวนที่เข้าและออกจากเส้นทางแสงจะเท่ากัน และความหนาแน่นของไมโตคอนเดรียในเส้นทางแสงจะไม่เปลี่ยนแปลงในระหว่างการทดลองที่ค่อนข้างสั้นเหล่านี้

เงื่อนไขของการทดสอบสเปกโตรโฟโตเมตริกของการใช้ออกซิเจนในไมโตคอนเดรียนั้นแตกต่างอย่างสิ้นเชิงจากการทดสอบโพลาโรกราฟิกที่คุ้นเคย ความหนาแน่นของไมโตคอนเดรียมีค่ามากกว่าประมาณ 100 เท่า ช่วงความเข้มข้นของ ADP ที่มากกว่า 4- ถึง 50 เท่าในระหว่างการกำหนดความดันออกซิเจนจะน้อยกว่าที่ใช้ในการทดสอบโพลาโรกราฟิกอย่างเห็นได้ชัด การทดลองที่แสดงในรูปที่ 1 ได้รับการออกแบบมาเพื่อแสดงว่าพารามิเตอร์ของฟังก์ชันยลไม่เปลี่ยนแปลงมากนัก อัตราการดูดซึมออกซิเจนที่ขาดหายไปอย่างรวดเร็ว โดยที่ ADP ถูกคำนวณให้หมดลง มีหลักฐานว่ามีการใช้ออกซิเจนร่วมกับการใช้ ADP อย่างแน่นหนา กิจกรรมเฉพาะเบื้องต้นคือ ∼200 mol O2 (โมลไซโตโครม aa3) –1 นาที –1 . อัตราส่วน P/O คือ 2.3, 2.4 และ 2.4 ที่ความเข้มข้นของ ADP เริ่มต้นที่ 500, 1000 และ 2000 μmol l –1 ตามลำดับ โดยมีดัชนีการควบคุมการหายใจ 3.1–3.4 สิ่งเหล่านี้เปรียบได้กับที่พบในการทดสอบโพลาโรกราฟิก: อัตราส่วน P/O 2.4 กับ RCI>6 (NS=24) นี่แสดงให้เห็นว่าการดูดซึมออกซิเจนในไมโตคอนเดรียที่วัดได้ในการทดสอบนี้ ควบคู่ไปกับการใช้ ADP อย่างแน่นหนา และดำเนินการในอัตราที่สมส่วนกับการรับออกซิเจนในสถานะ III ที่วัดแบบโพลาโรกราฟิก

ปริมาณการใช้ออกซิเจนที่รายงานโดย myoglobin deoxygenation ที่ถูกเฝ้าติดตามที่ 625 nm ถูกกำหนดในสารแขวนลอยยลที่มี myoglobin และจำกัดปริมาณของ ADP ADP หมดที่ลูกศร ไมโอโกลบิน, 500 ไมโครโมล ล. –1 . A, 500 ไมโครโมลลิตร –1 ADP B, 1000 ไมโครโมลลิตร –1 ADP C, 2000 ไมโครโมลลิตร –1 ADP อัตราเริ่มต้นคือ ∼200 mol O2 (โมลไซโตโครม aa3) –1 นาที –1 . อัตราส่วน P/O คือ 2.3, 2.4 และ 2.4 ตามลำดับ โดยมีดัชนีการควบคุมการหายใจที่ 3.1–3.4 อัตราส่วน P/O ของการเตรียมไมโตคอนเดรียที่กำหนดโดยโพลาโรกราฟิกคือ 2.4 ด้วย RCI>6 นี่แสดงให้เห็นว่าการดูดซึมออกซิเจนในไมโตคอนเดรียนั้นเชื่อมโยงกับฟอสโฟรีเลชันอย่างแน่นหนาเมื่อไมโตคอนเดรียใช้ออกซิเจนที่จับกับไมโอโกลบิน AU หน่วยการดูดกลืนแสง

ปริมาณการใช้ออกซิเจนที่รายงานโดย myoglobin deoxygenation ที่ถูกเฝ้าติดตามที่ 625 nm ถูกกำหนดในสารแขวนลอยยลที่มี myoglobin และจำกัดปริมาณของ ADP ADP หมดที่ลูกศร ไมโอโกลบิน, 500 ไมโครโมล ล. –1 . A, 500 ไมโครโมลลิตร –1 ADP B, 1000 ไมโครโมลลิตร –1 ADP C, 2000 ไมโครโมลลิตร –1 ADP อัตราเริ่มต้นคือ ∼200 mol O2 (โมลไซโตโครม aa3) –1 นาที –1 . อัตราส่วน P/O คือ 2.3, 2.4 และ 2.4 ตามลำดับ โดยมีดัชนีการควบคุมการหายใจที่ 3.1–3.4 อัตราส่วน P/O ของการเตรียมไมโตคอนเดรียที่กำหนดโดยโพลาโรกราฟิกคือ 2.4 ด้วย RCI>6 นี่แสดงให้เห็นว่าการดูดซึมออกซิเจนในไมโตคอนเดรียนั้นเชื่อมโยงกับฟอสโฟรีเลชันอย่างแน่นหนาเมื่อไมโตคอนเดรียใช้ออกซิเจนที่จับกับไมโอโกลบิน AU หน่วยการดูดกลืนแสง

Myoglobin ไม่มีปฏิกิริยากับพื้นผิวไมโตคอนเดรีย

อัตราการดูดซึมออกซิเจนที่วัดได้ทางขั้วโดยการระงับไมโทคอนเดรียหัวใจของนกพิราบจะเปลี่ยนแปลงเพียงเล็กน้อยโดยการเติมออกซีเมียโอโกลบิน500μmol l –1 oxymyoglobin ซึ่งมีความเข้มข้นมากกว่าในโพรงของนกพิราบประมาณ 200 ไมโครโมลกิโลกรัม -1 เนื้อเยื่อมวลเปียก (Schuder และ Wittenberg, 1979), รูปที่ 2 อัตราส่วน P/O ในทำนองเดียวกัน ไม่ได้รับผลกระทบจากการมีอยู่ของ 500 ไมโครโมล l –1 myoglobin ตามที่อภิปรายไว้ด้านล่าง แต่ละฮีโมโกลบินที่แตกต่างกันทั้งหกชนิดที่ใช้ในการทดลองเหล่านี้สนับสนุนการดูดซึมออกซิเจนของไมโตคอนเดรียในระดับที่ใกล้เคียงกันโดยประมาณ ตารางที่ 1 และตารางที่ 2

สัมพรรคภาพออกซิเจนและค่าคงที่สมดุลของโปรตีนฮีมโมโนเมอร์ที่ใช้

. NS1/2 . . ค่าคงที่แบบผสม (mol l -1 s -1 ×10 -6 ) ค่าคงที่การแยกตัว (s -1 )
โปรตีนฮีม (กิโลปาสคาล). (มม.ปรอท). . .
Busycon Mb 0.11 0.81 48 71
ม้า Mb ข 0.056 0.43 14 11
Lucina Hb ฉัน c 0.044 0.34 100 61
Lucina Hb II c 0.021 0.16 0.39 0.11
ถั่วเหลืองปอนด์ 1 NS 0.003 0.021 124 4.9
แกสเทอโรฟิลัส Hb e 0.009 0.067 10 1.2
. NS1/2 . . ค่าคงที่แบบผสม (mol l -1 s -1 ×10 -6 ) ค่าคงที่การแยกตัว (s -1 )
โปรตีนฮีม (กิโลปาสคาล). (มม.ปรอท). . .
Busycon Mb 0.11 0.81 48 71
ม้า Mb ข 0.056 0.43 14 11
Lucina Hb ฉัน c 0.044 0.34 100 61
Lucina Hb II c 0.021 0.16 0.39 0.11
ถั่วเหลืองปอนด์ 1 NS 0.003 0.021 124 4.9
แกสเทอโรฟิลัส Hb e 0.009 0.067 10 1.2

Hb, เฮโมโกลบิน Mb, myoglobin Lb, เลฮีโมโกลบิน ค่าคงที่จลนศาสตร์จาก: a Busycon Mb (Schreiber and Parkhurst, 1984) b Horse Mb(Schenkman et al., 1997) c Lucina Hb I และ Hb II (Kraus and Wittenberg, 1990) d Leghemoglobin (Martin et al., 1990) และ Gasterophilus Hb (Phelps et al., 1972)

ความดันออกซิเจนและความอิ่มตัวของเศษส่วนของโปรตีน heme ที่การดูดซึมออกซิเจนสูงสุดครึ่งหนึ่งของไมโตคอนเดรียหัวใจที่แยกได้จากสถานะ III

. ความอิ่มตัวของเศษส่วน แรงดันออกซิเจน .
โปรตีนฮีม (%) . (กิโลปาสคาล). (มม.ปรอท).
Busycon Mb 3.9 0.0047 0.035
ม้า Mb 4.7 0.0094 0.071
Lucina Hb ฉัน 9.1 0.0024 0.018
Lucina Hb II 24 0.0067 0.050
ถั่วเหลืองปอนด์ 41 0.0067 0.050
Gasterophilus Hb 31 0.0015 0.011
หมายถึง 0.0052 0.040
. ความอิ่มตัวของเศษส่วน แรงดันออกซิเจน .
โปรตีนเฮม. (%) . (กิโลปาสคาล). (มม.ปรอท).
Busycon Mb 3.9 0.0047 0.035
ม้า Mb 4.7 0.0094 0.071
Lucina Hb ฉัน 9.1 0.0024 0.018
Lucina Hb II 24 0.0067 0.050
ถั่วเหลืองปอนด์ 41 0.0067 0.050
Gasterophilus Hb 31 0.0015 0.011
หมายถึง 0.0052 0.040

Hb, เฮโมโกลบิน Mb, myoglobin Lb, เลฮีโมโกลบิน

ความคืบหน้าของการลดออกซิเจนของฮีโมโกลบินระหว่างการทดลอง

การทดลองเหล่านี้สำรวจความดันออกซิเจนต่ำเทียบได้กับความดันออกซิเจนในซาร์โคพลาสมิก ซึ่งการดูดซึมออกซิเจนจะถูกจำกัดโดยความพร้อมของออกซิเจนในกรณีที่ไม่มีฮีโมโกลบินหรือไมโอโกลบิน ความคืบหน้าของการทดลองลดออกซิเจนของไมโอโกลบิน (P50=0.09 kPa ∼0.7 mmHg) หรือเลฮีโมโกลบิน (NS50=0.009 kPa ∼0.07 mmHg) รายงานการรับออกซิเจนในไมโตคอนเดรียแสดงในรูปที่ 3 พิกัดรายงานออกซิเจนของเฮโมโกลบิน ในขั้นต้น ออกซิเจนมีอยู่ในปริมาณที่มากเกินไปเล็กน้อย ฮีโมโกลบินส่วนใหญ่จะได้รับออกซิเจนอย่างเต็มที่ และร่องรอยจะโค้งลงเมื่อการหายใจของไมโตคอนเดรียดึงปริมาณสำรองของออกซิเจนที่ละลายน้ำและออกซิเจนที่จับกับฮีโมโกลบิน ต่อมา การจัดเก็บออกซิเจนละลายน้ำจะมีขนาดเล็กเมื่อเทียบกับการเก็บออกซิเจนที่จับกับฮีโมโกลบิน ความสมดุลระหว่างออกซีเฮโมโกลบินและออกซิเจนอิสระจะบัฟเฟอร์อัตราการเปลี่ยนแปลงของความดันออกซิเจน และร่องรอยเข้าใกล้ความเป็นเส้นตรง อัตราของ deoxygenation ของเฮโมโกลบินรายงานอัตราการบริโภคออกซิเจน mitochondrial ที่สนับสนุนเฮโมโกลบินในสภาวะใกล้คงที่ ความดันออกซิเจนที่อัตราการรับออกซิเจนสูงสุดครึ่งหนึ่งรายงานโดยจุดที่อัตราการเปลี่ยนแปลงของ deoxygenation ของเฮโมโกลบินเท่ากับครึ่งหนึ่งในช่วงก่อนหน้าของส่วนกึ่งเชิงเส้นตรงของเส้นโค้งความคืบหน้า ซึ่งระบุโดยลูกศรในรูปที่ 3 เส้นโค้งความคืบหน้าสองเส้นแตกต่างกัน การหายใจแบบ half-maximal เมื่อมี leghemoglobin ที่มีสัมพรรคภาพสูงเกิดขึ้นเมื่อโปรตีนอยู่ที่ 57% ออกซิเจนที่ myoglobin ที่มีสัมพรรคภาพต่ำจะเกิดเมื่อโปรตีน 94% ถูกกำจัดออกซิเจน ดังนั้น หน้าที่ของไมโตคอนเดรียจึงไม่ขึ้นอยู่กับธรรมชาติของฮีโมโกลบินที่รองรับและความอิ่มตัวของออกซิเจนในเศษส่วน

ความดันออกซิเจนในสารแขวนลอยของไมโตคอนเดรียรายงานเชิงขั้วเป็นฟังก์ชันของเวลา (1 torr=0.133 kPa) เพิ่ม ADP (500 nmol) ที่ลูกศร A, myoglobin ขาด B, 500 μmol l –1 oxymyoglobin การรับออกซิเจนโดยเฉลี่ยเมื่อมี ADP เพียงพอคือ 193 และ 157 โมล O2 (โมลไซโตโครม aa3) –1 นาที –1 ในกรณีที่ไม่มี myoglobin และมีอยู่ตามลำดับ อัตราส่วน P/O คือ 2.21 และ 2.20 ความเข้มข้นของ myoglobin ที่ใช้ในที่นี้สูงกว่าความเข้มข้นเฉลี่ยของปริมาตรในหัวใจนกพิราบ 209 μmol l –1 (Schuder et al.,1979) ผลลัพธ์เหล่านี้แสดงให้เห็นว่า myoglobin ในสารละลายไม่ส่งผลต่อพารามิเตอร์ทางเดินหายใจของไมโตคอนเดรียที่แยกได้

ความดันออกซิเจนในสารแขวนลอยของไมโตคอนเดรียรายงานเชิงขั้วเป็นฟังก์ชันของเวลา (1 torr=0.133 kPa) เพิ่ม ADP (500 nmol) ที่ลูกศร A, myoglobin ขาด B, 500 μmol l –1 oxymyoglobin การรับออกซิเจนโดยเฉลี่ยเมื่อมี ADP เพียงพอคือ 193 และ 157 โมล O2 (โมลไซโตโครม aa3) –1 นาที –1 ในกรณีที่ไม่มี myoglobin และมีอยู่ตามลำดับ อัตราส่วน P/O คือ 2.21 และ 2.20 ความเข้มข้นของ myoglobin ที่ใช้ในที่นี้สูงกว่าความเข้มข้นเฉลี่ยของปริมาตรในหัวใจนกพิราบ 209 μmol l –1 (Schuder et al.,1979) ผลลัพธ์เหล่านี้แสดงให้เห็นว่า myoglobin ในสารละลายไม่ส่งผลต่อพารามิเตอร์ทางเดินหายใจของไมโตคอนเดรียที่แยกได้

ความดันออกซิเจนที่อัตราครึ่งสูงสุดของการดูดซึมออกซิเจนในไมโตคอนเดรีย

ความดันออกซิเจนที่ได้รับจากการดูดซึมออกซิเจนในไมโตคอนเดรียสูงสุดครึ่งหนึ่งซึ่งมีฮีโมโกลบิน 6 ตัวรองรับด้วยค่าคงที่จลนศาสตร์และสมดุลที่ต่างกันมากในปฏิกิริยากับออกซิเจน (ตารางที่ 1) แสดงไว้ในตารางที่ 2 เห็นได้ชัดว่าความดันออกซิเจนเกือบเท่ากัน (พิสัย) 0.0015–0.0095 kPa0.011–0.071 mmHg ค่าเฉลี่ย NSโอ2= 0.005 kPa0.040 mmHg) เหนือกว่าที่การส่งออกซิเจนสูงสุดครึ่งหนึ่งโดยแต่ละเฮโมโกลบิน ไม่มีความสัมพันธ์ระหว่างอัตราครึ่งสูงสุดกับความสัมพันธ์ของออกซิเจนของโปรตีนหรือกับค่าคงที่ของอัตราการรวมกันหรืออัตราการแยกตัว ค่าที่แสดงในตารางที่ 2 ใกล้เคียงกับค่า NSโอ2 สำหรับการหายใจสูงสุดของไมโตคอนเดรียที่แยกได้จากแหล่งต่างๆ ที่เรียกว่า KNS สำหรับออกซิเจน (ตรวจสอบโดย Wilson et al., 1988) แม้แต่ค่าสูงสุด (≈0.01 kPa ∼0.10 mmHg) ที่พบในไมโตคอนเดรียซึ่งมีกิจกรรมเฉพาะเพิ่มขึ้นเป็นสองเท่าโดยประมาณ ก็ยังอยู่ในซองจดหมายของค่าที่รายงานสำหรับ KNS.

การดูดซึมออกซิเจนในไมโตคอนเดรียเป็นหน้าที่ของความเข้มข้นของฮีโมโกลบิน

การดูดซึมออกซิเจนในไมโตคอนเดรียจะเพิ่มขึ้นเมื่อมีไมโอโกลบิน เราตรวจสอบความสัมพันธ์ระหว่างความเข้มข้นของ myoglobin กับการเพิ่มประสิทธิภาพนี้ อัตราการดูดซับออกซิเจนในไมโตคอนเดรีย ซึ่งวัดโดยความชันของส่วนใกล้เชิงเส้นของเส้นโค้งความคืบหน้า (รูปที่ 3) เพิ่มขึ้นแบบโมโนโทนด้วยความเข้มข้นของเฮโมโกลบินเพื่อให้ได้ที่ราบที่การดูดซึมออกซิเจนไม่ขึ้นกับความเข้มข้นของเฮโมโกลบิน (รูปที่ 4) หน้าที่ที่แสดงในรูปที่ 4 นั้นเหมือนกันสำหรับ leghemoglobin, myoglobin และ Busycon myoglobin (ไม่แสดงข้อมูล) โปรตีนที่แตกต่างกัน 10 เท่าในจลนศาสตร์และสมดุลของปฏิกิริยากับออกซิเจน (ตารางที่ 1) การรับออกซิเจนยังไม่ขึ้นอยู่กับระดับของความอิ่มตัวของออกซิเจนของเฮโมโกลบินภายในช่วงเชิงเส้นของการทดลองที่แสดงในรูปที่ 3 การค้นพบนี้ยืนยันข้อสรุปว่าการรับออกซิเจนที่ขึ้นกับเฮโมโกลบินไม่เกี่ยวข้องกับปฏิกิริยาของเฮโมโกลบินกับพื้นผิวไมโตคอนเดรีย อัตราสูงสุดของการดูดซึมของออกซิเจนที่ส่งมาจากเฮโมโกลบินไม่แตกต่างอย่างมีนัยสำคัญจากอัตราการดูดซึมออกซิเจนในสถานะ III ที่กำหนดโดยโพลาโรกราฟิกในกรณีที่ไม่มีฮีโมโกลบิน เราสรุปได้ว่า oxyhemoglobins ที่เพิ่มเข้ามาจะไม่เปลี่ยนแปลงกิจกรรมจำเพาะของไมโตคอนเดรีย แต่ช่วยลดข้อจำกัดในการรับออกซิเจนในไมโตคอนเดรียซึ่งกำหนดโดยออกซิเจนที่ละลายน้ำได้ในปริมาณจำกัดที่ระดับต่ำ NSโอ2.

Myoglobin และ leghemoglobin deoxygenation เป็นหน้าที่ของเวลาในสารแขวนลอยที่ประกอบด้วยเฮโมโกลบินของไมโตคอนเดรีย เริ่มแรกฮีโมโกลบินจะได้รับออกซิเจนเต็มที่ Deoxygenation ลดลง (A) ไมโอโกลบิน 50 ไมโครโมล ล. –1 ไมโตคอนเดรีย (ในรูปของไซโตโครม aa3) 170 nmol l –1 , เส้นทางแสง 10 มม. (A, สิ่งที่ใส่เข้าไป) Myoglobin 500 μmol l –1 mitochondria (เป็น cytochrome aa3) 700 nmol l –1 , เส้นทางแสง 2 มม. (B) เลฮีโมโกลบิน , 50μmol l –1 mitochondria (ในรูปของ cytochrome aa3) 65 nmol l –1 , เส้นทางแสง 10 มม. เส้นที่หักจะถูกวาดที่สัมผัสกับส่วนที่เกือบเป็นเส้นตรงของเส้นโค้ง ลูกศรระบุจุดที่อัตราการดูดออกซิเจนของไมโตคอนเดรียครึ่งหนึ่งในช่วงส่วนใกล้เส้นตรงของกราฟแสดงความคืบหน้า การดูดซึมออกซิเจนในสถานะกึ่งคงที่ที่คำนวณจากความชันของเส้นที่หักคือ 204 และ 358 โมล O2 (โมลไซโตโครม aa3) –1 นาที –1 สำหรับ myoglobin และ leghemoglobin ตามลำดับ ความดันออกซิเจนที่การดูดซึมออกซิเจนสูงสุดครึ่งหนึ่งพบว่าเท่ากันสำหรับโปรตีนสองชนิดซึ่งความชอบจับต่างกัน 10 เท่า (ดูตารางที่ 2) นี่แสดงว่า NSโอ2 สำหรับการดูดซึมออกซิเจนในไมโทคอนเดรียสูงสุดครึ่งหนึ่งไม่เกี่ยวข้องกับความสัมพันธ์ของออกซิเจนของเฮมโปรตีนที่จ่ายออกซิเจน AU หน่วยการดูดกลืนแสง

Myoglobin และ leghemoglobin deoxygenation เป็นหน้าที่ของเวลาในสารแขวนลอยที่ประกอบด้วยเฮโมโกลบินของไมโตคอนเดรีย เริ่มแรกฮีโมโกลบินจะได้รับออกซิเจนเต็มที่ Deoxygenation ลดลง (A) ไมโอโกลบิน 50 ไมโครโมล ล. –1 ไมโตคอนเดรีย (ในรูปของไซโตโครม aa3) 170 nmol l –1 , เส้นทางแสง 10 มม. (A, สิ่งที่ใส่เข้าไป) Myoglobin 500 μmol l –1 mitochondria (เป็น cytochrome aa3) 700 nmol l –1 , เส้นทางแสง 2 มม. (B) เลฮีโมโกลบิน , 50μmol l –1 mitochondria (ในรูปของ cytochrome aa3) 65 nmol l –1 , เส้นทางแสง 10 มม. เส้นที่หักจะถูกวาดที่สัมผัสกับส่วนที่เกือบเป็นเส้นตรงของเส้นโค้ง ลูกศรระบุจุดที่อัตราการดูดออกซิเจนของไมโตคอนเดรียครึ่งหนึ่งในช่วงส่วนใกล้เส้นตรงของกราฟแสดงความคืบหน้า การดูดซึมออกซิเจนในสถานะกึ่งคงที่ที่คำนวณจากความชันของเส้นที่หักคือ 204 และ 358 โมล O2 (โมลไซโตโครม aa3) –1 นาที –1 สำหรับ myoglobin และ leghemoglobin ตามลำดับ ความดันออกซิเจนที่การรับออกซิเจนสูงสุดครึ่งหนึ่งจะเท่ากันสำหรับโปรตีนสองชนิดซึ่งความชอบจับต่างกัน 10 เท่า (ดูตารางที่ 2) นี่แสดงว่า NSโอ2 สำหรับการดูดซึมออกซิเจนในไมโตคอนเดรียสูงสุดครึ่งหนึ่งไม่เกี่ยวข้องกับความสัมพันธ์ของออกซิเจนของเฮมโปรตีนที่จ่ายออกซิเจน AU หน่วยการดูดกลืนแสง

ผลของกิจกรรมจำเพาะยลที่เพิ่มขึ้น

ไมโตคอนเดรียของหัวใจและกล้ามเนื้อโครงร่างสีแดงปรับอัตราของการเกิดปฏิกิริยาออกซิเดชันฟอสโฟรีเลชันเพื่อให้สอดคล้องกับการเปลี่ยนแปลงของการทำงานของกล้ามเนื้อในสภาวะคงตัวที่มีขนาดใหญ่มาก กล่าวคือ 10 เท่าหรือมากกว่านั้น ดังนั้นจึงเป็นเรื่องที่น่าสนใจที่จะตรวจสอบการตอบสนองของการส่งออกซิเจนที่ขึ้นกับ myoglobin ต่อการเปลี่ยนแปลงในกิจกรรมที่จำเพาะของยล กิจกรรมจำเพาะของไมโตคอนเดรียที่เพิ่มขึ้นประมาณสองเท่าโดยประมาณจะเพิ่มอัตราการรับออกซิเจนสูงสุดเป็นสองเท่าโดยประมาณที่ที่ราบสูงและแรงดันออกซิเจนที่จำเป็นมากกว่าสองเท่าเพื่อให้ได้อัตราสูงสุดครึ่งหนึ่งเป็นค่า ∼0.01 kPa (∼0.10 mmHg) (รูปที่ 5) ความเข้มข้นของ myoglobin (ประมาณ 300 μmol l –1 ) ที่จำเป็นต่อการรักษาอัตราการหายใจเต็มที่นั้นมากกว่าที่ต้องการในอัตราที่น้อยกว่าประมาณห้าเท่า และเทียบได้กับความเข้มข้นของ myoglobin โดยเฉลี่ยในโพรงของนกพิราบ 209 μmol kg –1 มวลเปียก (Schuder et al., 1979).

การดูดซึมออกซิเจนในไมโตคอนเดรียเป็นหน้าที่ของความเข้มข้นของไมโอโกลบินหรือเลเฮโมโกลบิน สัญลักษณ์ปิด, สัญลักษณ์เปิด myoglobin, เลเฮโมโกลบิน . สัญลักษณ์ต่างๆ แสดงถึงการทดลองที่แตกต่างกัน ยกเว้นจุดต่ำสุดสองจุด อัตราการดูดออกซิเจนเป็นอัตราที่รายงานโดยสเปกโตรโฟโตเมตรีโดยอัตรา deoxygenation ของ myoglobin หรือ leghemoglobin ในสภาวะใกล้คงที่ ดังในรูปที่ 3 แต่ละจุดคือค่าเฉลี่ยของการวัดในเจ็ด (myoglobin) หรือ การเตรียมสอง (leghemoglobin) ของไมโตคอนเดรียที่แยกได้ จุดต่ำสุดสองจุดถูกกำหนดโดยใช้ความเข้มข้นการติดตามของ myoglobin หรือ leghemoglobin เป็นผู้รายงานความดันออกซิเจน การดูดซึมออกซิเจนจะถูกทำให้เป็นมาตรฐานจนถึงค่าที่ราบสูงซึ่งกำหนดโดยกิจกรรมเฉพาะที่กำหนดเชิงขั้ว อัตราส่วนของอัตราการดูดออกซิเจนที่ที่ราบสูงของรูปนี้กับค่าที่กำหนดเชิงขั้วคือ 0.91, 0.77 และ 1.30 ในการทดลองโดยใช้ myoglobin และ 0.76, 0.96 และ 0.92 ในการทดลองโดยใช้เลเฮโมโกลบิน

การดูดซึมออกซิเจนในไมโตคอนเดรียเป็นหน้าที่ของความเข้มข้นของไมโอโกลบินหรือเลเฮโมโกลบิน สัญลักษณ์ปิด, สัญลักษณ์เปิด myoglobin, เลเฮโมโกลบิน . สัญลักษณ์ต่างๆ แสดงถึงการทดลองที่แตกต่างกัน ยกเว้นจุดต่ำสุดสองจุด อัตราการดูดออกซิเจนเป็นอัตราที่รายงานโดยสเปกโตรโฟโตเมตรีโดยอัตรา deoxygenation ของ myoglobin หรือ leghemoglobin ในสภาวะใกล้คงที่ ดังในรูปที่ 3 แต่ละจุดคือค่าเฉลี่ยของการวัดในเจ็ด (myoglobin) หรือ การเตรียมสอง (leghemoglobin) ของไมโตคอนเดรียที่แยกได้ จุดต่ำสุดสองจุดถูกกำหนดโดยใช้ความเข้มข้นการติดตามของ myoglobin หรือ leghemoglobin เป็นผู้รายงานความดันออกซิเจน การดูดซึมออกซิเจนจะถูกทำให้เป็นมาตรฐานจนถึงค่าที่ราบสูงซึ่งกำหนดโดยกิจกรรมเฉพาะที่กำหนดเชิงขั้ว อัตราส่วนของอัตราการดูดซับออกซิเจนที่ที่ราบสูงของรูปนี้ต่อค่าที่กำหนดเชิงขั้วคือ 0.91, 0.77 และ 1.30 ในการทดลองโดยใช้ myoglobin และ 0.76, 0.96 และ 0.92 ในการทดลองโดยใช้เลเฮโมโกลบิน


ผลลัพธ์

ศึกษาการถ่ายภาพด้วยกล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอลของระบบเซลลูลาร์

รูปที่ 1, 2, 3 แสดงคุณลักษณะโดยละเอียดของคาร์ดิโอไมโอไซต์ที่ซึมผ่านได้และเส้นใยกล้ามเนื้อหัวใจที่ผิวหนังในสารละลาย B ที่มี pCa=7.0 ซึ่งสอดคล้องกับสถานะการพักของเซลล์ รูปที่ 1 แสดงการถ่ายภาพด้วยกล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอล ทั้งจากการเรืองแสงอัตโนมัติของฟลาโวโปรตีน (รูปที่ 1A) และแคลเซียมภายในเซลล์ (รูปที่ 1B) ของไมโทคอนเดรียในคาร์ดิโอไมโอไซต์ของหนูที่แยกได้และดูดซึมได้ในสารละลาย B คาร์ดิโอไมโอไซต์จะคลายตัวและมีรูปร่างเหมือนแท่ง และภายในเซลล์ ไมโทคอนเดรียจะถูกจัดเรียงอย่างสม่ำเสมอระหว่าง myofibrils รูปที่ 2 แสดงว่ากระบวนการ permeabilization เสร็จสมบูรณ์และช่วยให้การย้อมสีอิมมูโนฟลูออเรสเซนซ์ที่ดีเยี่ยมของเครือข่าย microtubular ในเซลล์ โครงข่ายไม่บุบสลาย แสดงให้เห็นว่าโครงร่างเซลล์ของเซลล์ได้รับการเก็บรักษาไว้อย่างดีในระหว่างขั้นตอนการซึมผ่าน อีกทางเลือกหนึ่งที่ง่ายและรวดเร็วและง่ายยิ่งขึ้นสำหรับการแยก cardiomyocytes คือการใช้เส้นใยกล้ามเนื้อที่ผ่านการซึมผ่าน (`skinned') ของกล้ามเนื้อ (รูปที่ 3) เทคนิคนี้ต้องการการแยกมัดของกล้ามเนื้อออกเป็นเส้นใยอย่างระมัดระวัง โดยที่เซลล์หัวใจรักษาการติดต่อซึ่งกันและกันที่แผ่นอินเตอร์คาเลต(Veksler et al., 1987 Saks et al., 1998a รูปที่ 3) แต่เส้นผ่านศูนย์กลางของเส้นใยนั้นเท่ากัน ของคาร์ดิโอไมโอไซต์ (10–20 ไมโครเมตร) และระยะการแพร่กระจาย (ตามลำดับ 5-10 ไมโครเมตร) และจลนพลศาสตร์การแพร่สำหรับซับสเตรตและ ADP จะเหมือนกับของคาร์ดิโอไมโอไซต์เสมอ (ตารางที่ 1) ในขณะที่การแยกตัวของ cardiomyocytes ต้องใช้หัวใจของหนูทั้งตัวและค่อนข้างใช้เวลานาน แต่เทคนิคของเส้นใยที่ซึมผ่านได้นั้นต้องการเนื้อเยื่อของกล้ามเนื้อเพียงไม่กี่มิลลิกรัม ซึ่งเป็นสิ่งสำคัญ ตัวอย่างเช่น ในการศึกษาของมนุษย์และทางคลินิก(Walsh et al., 2001 Kuznetsov et al., 1998). อย่างไรก็ตาม ทั้งสองวิธีนั้นดีพอๆ กันสำหรับการศึกษาประชากรทั้งหมดของไมโตคอนเดรียภายในเซลล์ในสภาพแวดล้อมตามธรรมชาติ

วัดชัดเจนKNS สำหรับ ADP จากภายนอกในการเตรียมเซลล์ที่มีการซึมผ่านต่างกัน และระยะการแพร่กระจายจากตัวกลางไปยังศูนย์กลางของเซลล์ (Rดิฟ)

การตระเตรียม . เส้นผ่านศูนย์กลางที่วัดได้ (มม.) . NSดิฟ (มม.). ชัดเจน KNS (ADP) (ไมโครโมล 1 -1 ) อ้างอิง .
คาร์ดิโอไมโอไซต์ 10-25 5-12.5 - Opie, 1998
- - 329±50 * การศึกษาปัจจุบัน
16 8 250±38 Saks et al., 1991
20 10 200-250 Kay et al., 1997
'ผี' cardiomyocytes 20 10 200-250 Kay et al., 1997
ผิวหนังของเส้นใยหัวใจ - - 297±35 Saks et al., 1993
20 10 300±23 Saks et al., 2001
- - 300-400 Seppet et al., 2001
- - 370±70 Boudina et al., 2002
- - 234±24 Liobikas et al., 2001
22 11 - Menin et al., 2001
- - 334±48 * การศึกษาปัจจุบัน
เส้นใยหัวใจ 'ผี' 20 10 349±24 Saks et al., 1993
- - 349±34 * การศึกษาปัจจุบัน
ผิวหนังของเส้นใยหัวใจ + ครีเอทีน - - 79±8 Saks et al., 1991
- - 85±5 Kuznetsov et al., 1996
ไมโตคอนเดรียหัวใจหนู ในหลอดทดลอง∼1 0 17.6±1 Saks et al., 1991
การตระเตรียม . เส้นผ่านศูนย์กลางที่วัดได้ (มม.) . NSดิฟ (มม.). ชัดเจน KNS (ADP) (ไมโครโมล 1 -1 ) อ้างอิง .
คาร์ดิโอไมโอไซต์ 10-25 5-12.5 - Opie, 1998
- - 329±50 * การศึกษาปัจจุบัน
16 8 250±38 Saks et al., 1991
20 10 200-250 Kay et al., 1997
'ผี' cardiomyocytes 20 10 200-250 Kay et al., 1997
ผิวหนังของเส้นใยหัวใจ - - 297±35 Saks et al., 1993
20 10 300±23 Saks et al., 2001
- - 300-400 Seppet et al., 2001
- - 370±70 Boudina et al., 2002
- - 234±24 Liobikas et al., 2001
22 11 - Menin et al., 2001
- - 334±48 * การศึกษาปัจจุบัน
เส้นใยหัวใจ 'ผี' 20 10 349±24 Saks et al., 1993
- - 349±34 * การศึกษาปัจจุบัน
ผิวหนังของเส้นใยหัวใจ + ครีเอทีน - - 79±8 Saks et al., 1991
- - 85±5 Kuznetsov et al., 1996
ไมโตคอนเดรียหัวใจหนู ในหลอดทดลอง∼1 0 17.6±1 Saks et al., 1991

วัดในงานนี้สำหรับการเตรียมการที่คล้ายกับที่อธิบายไว้ในรูปที่ 1 ระยะการแพร่กระจายถูกกำหนดเพื่อประเมินอัตราการเคลื่อนที่แบบบราวเนียนของ ADP ในน้ำ หากจำเป็น (Saks et al.,2001)

ลักษณะระบบทางเดินหายใจของระบบเซลล์ที่ซึมผ่านได้

อัตราของการเกิดออกซิเดชันฟอสโฟรีเลชัน (การผลิตไมโตคอนเดรีย ATP) ถูกควบคุมโดย ADP เนื่องจากปรากฏการณ์การควบคุมการหายใจ (โอกาสและวิลเลียมส์, 1956) ความสัมพันธ์ของปฏิกิริยาออกซิเดชันฟอสโฟรีเลชันสำหรับ ADP มีลักษณะเชิงปริมาณโดยชัดเจน KNS สำหรับ ADP สำหรับไมโตคอนเดรียที่แยกเดี่ยวในสารแขวนลอยที่เป็นเนื้อเดียวกัน ค่าคงที่นี้สำหรับ ADP ในตัวกลาง (ADP จากภายนอก) นั้นต่ำมาก 10–20 ไมโครโมล -1 เนื่องจากการซึมผ่านสูงของเยื่อหุ้มไมโตคอนเดรียชั้นนอก (Klingenberg, 1970) และสูง ความสัมพันธ์ของอะดีนีนนิวคลีโอไทด์ translocator สำหรับสารตั้งต้นนี้(Vignais, 1976) อย่างไรก็ตาม เมื่อศึกษาไมโตคอนเดรียในเซลล์ที่ซึมผ่านได้ ในที่เกิดเหตุ, ผลลัพธ์ต่างกันมาก (Saks et al.,1998a).

ตารางที่ 1 สรุปสัมพรรคภาพที่วัดได้ของไมโทคอนเดรียสำหรับ ADP จากภายนอกในการเตรียมการที่แตกต่างกันก่อน (เซลล์ที่ถูกดูดซึมโดยสมบูรณ์) และหลัง (เซลล์โกสต์หรือเส้นใย) การสกัดไมโอซิน แม้จะมีระยะการแพร่กระจายที่น้อยมาก(mean=10 μm) จากตัวกลางไปยังแกนกลางของเซลล์ (รูปที่ 1, 2, 3) ในทุกกรณีความสัมพันธ์จะต่ำมากเมื่อเทียบกับค่าที่เห็นได้ชัด KNS สำหรับ ADP จากภายนอก (300–400μmoll -1 ) การสังเกตที่สำคัญที่แสดงในตารางที่ 1 คือการกระตุ้นปฏิกิริยา mitochondrial creatine kinase (miCK) ลดค่าของปรากฏ KNS สำหรับ ADP ภายนอก นี่เป็นเพราะการทำงานร่วมกันของปฏิกิริยา miCK กับปฏิกิริยาออกซิเดชันฟอสโฟรีเลชัน ทางadenine nucleotide translocator(Barbour et al., 1984 Joubert et al., 2002 Saks et al., 1975, 1994, 1995 Wallimann et al., 1992 Wyss and Kaddurah-Daouk,2000) ซึ่งนำไปสู่การหมุนเวียนในท้องถิ่นที่เพิ่มขึ้นของ adenine นิวคลีโอไทด์ในไมโทคอนเดรีย การผลิตฟอสโฟครีเอทีนแบบแอโรบิกที่มีประสิทธิภาพ และความเสถียรในการเผาผลาญของหัวใจ (Garlid,2001 Kay et al.,2000 Saks et al., 1995) สิ่งนี้เน้นย้ำถึงบทบาทของ miCK ในการควบคุมการหายใจของไมโตคอนเดรียในเซลล์กล้ามเนื้อ (Joubert et al., 2002 Kay et al., 2000 Saks et al., 2001 Walsh et al., 2001)

หลักฐานเพิ่มเติมสำหรับการควบคุมการหายใจในท้องถิ่นโดย miCK แสดงไว้ในรูปที่ 4 ซึ่งแสดงการบันทึก oxygraph ของการหายใจแบบยลในเส้นใยหัวใจที่ผิวหนังเมื่อ ADP ถูกผลิตขึ้นภายในปฏิกิริยา MgATPase ของเซลล์เมื่อมี 2mmoll -1 MgATP การผลิต ADP ภายนอกกระตุ้นการหายใจหลายครั้ง ภายหลังการเพิ่มระบบที่แข่งขันกับไมโทคอนเดรียสำหรับ ADP (Gellerich and Saks,1982) ซึ่งประกอบด้วยไพรูเวตไคเนส (PK) ที่มีความเข้มข้นสูงและฟอสโฟอีนอลไพรูเวต (PEP) ลดอัตราการหายใจ แต่ไม่เกิน 40% การเติมครีเอทีนเพิ่มอัตราการหายใจเป็นค่าสูงสุดที่สังเกตได้ในสถานะ 3 นี่เป็นอีกครั้งเนื่องจากการกระตุ้นการผลิต ADP ในท้องถิ่นโดย miCK ในพื้นที่เยื่อหุ้มเซลล์ของไมโตคอนเดรีย และ ADP ที่ผลิตในท้องถิ่นนี้ไม่สามารถเข้าถึงได้โดยสิ้นเชิงสำหรับ PK จากภายนอก แต่ส่งไปยัง adenine nucleotide translocator และขนส่งไปยัง mitochondrial matrix (ดูด้านบน)

การบันทึกอัตราการหายใจในเส้นใยกล้ามเนื้อหัวใจที่ซึมผ่านได้ซึ่งกระตุ้นโดยการผลิต ADP ภายนอกในปฏิกิริยา MgATPase ร่องรอยแสดงอัตราการเปลี่ยนแปลงของความเข้มข้นของออกซิเจนในเวลาในเซลล์ออกซิกราฟ อัตราการหายใจถูกวัดเมื่อมี 5mmoll -1 glutamate บวก 2mmoll -1 malate ตามที่อธิบายไว้ในวัสดุและวิธีการ การเติม 2mmoll -1 ATP และความเข้มข้นสุดท้ายที่หลากหลายของ pyruvate kinase (PK) ต่อหน้า 2mmoll -1 phosphoenolpyruvate (PEP) ในตัวกลางจะถูกระบุ เมื่อสิ้นสุดการทดลอง เติม 20mmoll -1 creatine ลูกศรแสดงเวลาของการบวก ผลการวิจัยแสดงให้เห็นถึงผลการยับยั้งของระบบ pyruvate kinase (PK)–PEP ที่แข่งขันกันสำหรับ ADP ภายในร่างกายต่ออัตราการหายใจและผลกระตุ้นของ creatine เนื่องจากปฏิกิริยาของ creatine kinase ควบคู่เมื่อมี PK การยับยั้งการหายใจเพียงเล็กน้อยโดยกิจกรรม PK ที่สูงมาก (20i.u.ml -1 ) แสดงให้เห็นถึงการแบ่งส่วนและช่องทางโดยตรงของ ADP ภายนอก ผลกระทบของการแชนเนลโดยตรงเหล่านี้จะเพิ่มขึ้นหลังจากการกระตุ้นไมโตคอนเดรีย ครีเอทีน ไคเนส

การบันทึกอัตราการหายใจในเส้นใยกล้ามเนื้อหัวใจที่ซึมผ่านได้ซึ่งกระตุ้นโดยการผลิต ADP ภายนอกในปฏิกิริยา MgATPase ร่องรอยแสดงอัตราการเปลี่ยนแปลงของความเข้มข้นของออกซิเจนในเวลาในเซลล์ออกซิกราฟ อัตราการหายใจถูกวัดเมื่อมี 5mmoll -1 glutamate บวก 2mmoll -1 malate ตามที่อธิบายไว้ในวัสดุและวิธีการ การเติม 2mmoll -1 ATP และความเข้มข้นสุดท้ายที่หลากหลายของ pyruvate kinase (PK) ต่อหน้า 2mmoll -1 phosphoenolpyruvate (PEP) ในตัวกลางจะถูกระบุ เมื่อสิ้นสุดการทดลอง เติม 20mmoll -1 creatine ลูกศรแสดงเวลาของการบวก ผลการวิจัยแสดงให้เห็นถึงผลการยับยั้งของระบบ pyruvate kinase (PK)–PEP ที่แข่งขันกันสำหรับ ADP ภายในร่างกายต่ออัตราการหายใจและผลกระตุ้นของ creatine เนื่องจากปฏิกิริยาของ creatine kinase ควบคู่เมื่อมี PK การยับยั้งการหายใจเพียงเล็กน้อยโดยกิจกรรม PK ที่สูงมาก (20i.u.ml -1 ) แสดงให้เห็นถึงการแบ่งส่วนและช่องทางโดยตรงของ ADP ภายนอก ผลกระทบของการแชนเนลโดยตรงเหล่านี้จะเพิ่มขึ้นหลังจากการกระตุ้นไมโตคอนเดรีย ครีเอทีน ไคเนส

คำอธิบายของข้อมูลการทดลองเหล่านี้และประสิทธิภาพต่ำของการยับยั้งการหายใจโดย PK จากภายนอก สามารถพบได้โดยใช้แบบจำลองทางคณิตศาสตร์ของการแพร่กระจาย ADP และการถ่ายโอนพลังงานภายในเซลล์ (ดูวัสดุและวิธีการ) รูปที่ 5แสดงผลการคำนวณอัตราการหายใจสำหรับสองสถานการณ์ที่แตกต่างกัน อย่างแรก ค่าสัมประสิทธิ์การแพร่ NSสำหรับ ADP และ ATP ถูกนำมาให้เท่ากับระยะน้ำปริมาณมากของเซลล์ NS0=145 μm -2 s -1 (Aliev and Saks, 1997) ในกรณีนี้เนื่องจากระยะการแพร่กระจายน้อยและอัตราการแพร่สูง (ค่าสูงของ NS) ATP และ ADP มีการแลกเปลี่ยนกันอย่างรวดเร็วระหว่างช่องว่างนอกเซลล์และช่องว่างภายในเซลล์ และ ADP ที่ผลิตภายในเซลล์ในปฏิกิริยา MgATPase ของเซลล์นั้นถูกใช้อย่างรวดเร็วมากโดย PK (เส้นทึบในรูปที่ 5) ผลที่ได้คือการหายใจถูกระงับอย่างมีประสิทธิภาพเมื่อมี PK ที่กิจกรรมที่ต่ำกว่า 5i.u.ml -1 ในตัวกลาง (เส้นทึบในรูปที่ 5) ข้อมูลเหล่านี้สอดคล้องกับข้อสรุปก่อนหน้านี้ของเราว่าการเคลื่อนที่แบบบราวเนียนของ ADP ในระยะน้ำในช่วง 10 ไมโครเมตรนั้นเร็วกว่าการหมุนเวียนเมแทบอลิซึมในไมโตคอนเดรียของหัวใจ (Saks et al.,2001)

แบบจำลองคอมพิวเตอร์ของข้อมูลที่แสดงในรูปที่ 4 เกี่ยวกับการลดอัตราการหายใจของไมโตคอนเดรีย ในที่เกิดเหตุ ในเซลล์หัวใจที่ซึมผ่านได้นั้นขึ้นอยู่กับ ADP ภายนอก (เมื่อมี 2mmoll -1 MgATP) โดยเพิ่มกิจกรรมไพรูเวตไคเนส (PK) สำหรับสองระบบที่แตกต่างกัน วี. อัตราการหายใจภายใต้สภาวะที่กำหนดV̇ อัตราการหายใจก่อนเติม ATPV̇ATP, อัตราการหายใจต่อหน้า 2mmoll -1 ATP เส้นทึบ: ค่าคงที่การแพร่กระจายของ ADP เป็น NS0 (ลักษณะการเคลื่อนที่แบบบราวเนียนในระยะน้ำ) เส้นหัก: ค่าสัมประสิทธิ์การแพร่ปรากฏชัดเจนถูกเปลี่ยนเพื่อให้พอดีกับข้อมูลการทดลอง (จุดแยกแสดงค่าเฉลี่ย ± SD ของอัตราการหายใจสำหรับกิจกรรมไพรูเวตไคเนสที่กำหนด) ได้ความสัมพันธ์ที่ดีระหว่างการจำลองและการวัดสำหรับ DF=10 -1.8

แบบจำลองคอมพิวเตอร์ของข้อมูลที่แสดงในรูปที่ 4 เกี่ยวกับการลดอัตราการหายใจของไมโตคอนเดรีย ในที่เกิดเหตุ ในเซลล์หัวใจที่ซึมผ่านได้นั้นขึ้นอยู่กับ ADP ภายนอก (เมื่อมี 2mmoll -1 MgATP) โดยเพิ่มกิจกรรมไพรูเวตไคเนส (PK) สำหรับสองระบบที่แตกต่างกัน วี. อัตราการหายใจภายใต้สภาวะที่กำหนดV̇ อัตราการหายใจก่อนเติม ATPV̇ATP, อัตราการหายใจต่อหน้า 2mmoll -1 ATP เส้นทึบ: ค่าคงที่การแพร่กระจายของ ADP เป็น NS0 (ลักษณะการเคลื่อนที่แบบบราวเนียนในระยะน้ำ) เส้นหัก: ค่าสัมประสิทธิ์การแพร่ปรากฏชัดเจนถูกเปลี่ยนเพื่อให้พอดีกับข้อมูลการทดลอง (จุดแยกแสดงค่าเฉลี่ย ± SD ของอัตราการหายใจสำหรับกิจกรรมไพรูเวตไคเนสที่กำหนด) ได้ความสัมพันธ์ที่ดีระหว่างการจำลองและการวัดสำหรับ DF=10 -1.8

อย่างไรก็ตาม เส้นโค้งของ NS0 ต่ำกว่าการพึ่งพาการทดลองมาก (รูปที่ 5 จุดทดลอง) เพื่อให้พอดีกับผลการทดลองที่อธิบายไว้ในรูปที่ 4 และ 5 เราจึงลดค่าสัมประสิทธิ์การแพร่เฉลี่ยที่เห็นได้ชัด (NSแอป=DF×NS0) ภายในเซลล์ โดยสมมติว่าการจัดโครงสร้างภายในเซลล์ในระดับสูง (ดูรูปที่ 1, 2, 3) อาจจำกัดการแพร่กระจายของอะดีนีนนิวคลีโอไทด์ (Saks et al.,2001) ความพอดีระหว่างผลลัพธ์ของการสร้างแบบจำลองและข้อมูลการทดลองถูกสังเกตเมื่อ DF เข้าใกล้ค่า 10 -2 (รูปที่ 5) ซึ่งหมายความว่าการแพร่กระจายภายในเซลล์ของ ADP (และ ATP) มีแนวโน้มที่จะต่างกันมากและถูกจำกัดอย่างมากในบางพื้นที่ภายในเซลล์ อาจเป็นไปได้ว่าสิ่งนี้เกิดขึ้นทั้งที่หรือใกล้เยื่อหุ้มไมโตคอนเดรียชั้นนอกและระหว่าง ICEUs (Aliev and Saks, 1997 Saks et al., 1994, 2001)

เป็นที่ทราบกันดีอยู่แล้วว่าค่าความชัดเจนสูง KNSสำหรับ ADP จากภายนอกจะลดลงอย่างมีนัยสำคัญจาก 300–350μmoll -1 เป็น 40–70 μmoll -1 โดยการคัดเลือกโปรตีโอไลซิส (Kuznetsov et al.,1996 Saks et al.,2001) การรักษา cardiomyocytes ที่ดูดซึมได้ในช่วงเวลาสั้น ๆ ด้วย 1 μmoll -1 trypsin ยังส่งผลให้เกิดความไม่เป็นระเบียบอย่างรวดเร็วของการจัดเรียงไมโตคอนเดรียใน cardiomyocytes ตามปกติและการล่มสลายใน microtubular network (Appaix et al.,2003) ดังนั้น เห็นได้ชัดว่าภายใต้เงื่อนไขเหล่านี้ โครงสร้างเฉพาะของ ICEU จะหายไป และข้อจำกัดภายในเซลล์เฉพาะที่สำหรับการแพร่กระจาย ADP จะถูกขจัดออกไป นี่อาจอธิบายการลดลงอย่างชัดเจน KNS สำหรับ ADP ภายนอก นอกจากนี้ เราได้แสดงให้เห็นก่อนหน้านี้ว่า หลังจากการบำบัดสลายโปรตีนที่คล้ายคลึงกัน ADP ภายในตัวจะสามารถเข้าถึงได้มากขึ้นสำหรับปฏิกิริยา PK จากภายนอก (Saks et al., 2001)

สมมติฐานของความแตกต่างของการแพร่กระจายภายในเซลล์ของ ADP ที่เกี่ยวข้องกับโครงสร้างของ ICEU นั้นสอดคล้องกับการค้นพบที่น่าประหลาดใจใหม่ที่อธิบายไว้ด้านล่าง

ความเชื่อมโยงที่ชัดเจนระหว่างความยาวของซาร์โคเมียร์และพารามิเตอร์จลนศาสตร์ของการควบคุมการหายใจ

ผลลัพธ์ที่ได้อธิบายไว้ในรูปที่ 6, 7, 8 แสดงปรากฏการณ์ใหม่ที่น่าสนใจ – ความเชื่อมโยงที่ชัดเจนระหว่างความยาวของซาร์โคเมียร์และความสัมพันธ์ของไมโตคอนเดรียสำหรับ ADP จากภายนอก โดยวัดเป็นความชัดเจน KNS สำหรับสารตั้งต้นนี้ในการควบคุมการหายใจของไมโตคอนเดรียในเซลล์ที่ซึมผ่านได้ ในที่เกิดเหตุ. ปรากฏการณ์นี้สังเกตได้เมื่อมีการศึกษาจลนพลศาสตร์ของการควบคุมการหายใจโดย ADP ที่ความเข้มข้นของแคลเซียมอิสระที่แตกต่างกันในสองระบบ: เส้นใยกล้ามเนื้อหัวใจที่ซึมผ่านได้และเส้นใย 'ผี' ที่ซึมผ่านได้หลังจากการสกัดไมโอซิน ความเข้มข้นของแคลเซียมอิสระเพิ่มขึ้นจาก 0.1 μmoll -1 เป็น 3μmoll -1 ซึ่งสอดคล้องกับช่วงความเข้มข้นทางสรีรวิทยา (Bers, 2001) รูปที่ 6 แสดงให้เห็นว่า เมื่อมี ATP (หรือสารตั้งต้นระบบทางเดินหายใจและ ADP) การเพิ่มขึ้นของความเข้มข้นของ Ca 2+ เป็น 3 μmoll -1 ส่งผลให้ sarcomeres หดตัวอย่างรุนแรงและทำให้ความยาวของเส้นใยสั้นลงในเส้นใยหัวใจที่ซึมผ่านได้ หากเส้นใยไม่ได้รับการแก้ไข ไมโตคอนเดรียระหว่างกล้ามเนื้อในกล้ามเนื้อดูเหมือนจะหลอมรวมอันเป็นผลมาจากการกดเข้าด้วยกัน หากเส้นใยถูกตรึงในเฟล็กซิเพอร์มและหดตัวแบบมีมิติเท่ากัน เราจะสังเกตลักษณะที่ปรากฏของพื้นที่ว่างและระยะห่างที่ค่อนข้างยาวระหว่างไมโตคอนเดรีย ในทั้งสองกรณี โครงสร้างของเซลล์และโครงสร้างของ ICEU ผิดรูป

การถ่ายภาพของไมโทคอนเดรียในเส้นใยกล้ามเนื้อหัวใจที่ซึมผ่านได้ด้วยโพรบที่ไวต่อเมมเบรน teramethylrhodamine ethyl ether (TMRE) (A)เส้นใยที่มี 2mmoll -1 ATP, 2mmoll -1 malate และ 5mmoll -1 glutamate (ความเข้มข้นของ Ca 2+ อิสระในบัฟเฟอร์ Ca-EGTA: 0.1 μmoll -1 ) (B) เส้นใยชนิดเดียวกันหลังจากเติมแคลเซียมคลอไรด์ (ความเข้มข้นสุดท้ายของ Ca 2+ ฟรีในบัฟเฟอร์ Ca-EGTA: 1.0 μmoll -1 ) เส้นใยด้านซ้ายในห้อง flexiperm ไม่ได้รับการแก้ไข ในขณะที่เส้นใยด้านขวา (ยาวกว่า) ได้รับการแก้ไขที่ปลาย ใน A เส้นใยทั้งสองจะผ่อนคลาย ใน B เส้นใยด้านซ้ายหดตัว ในขณะที่เส้นใยด้านขวาซึ่งหดตัวเกือบจะมีมิติเท่ากัน แสดงให้เห็นการเปลี่ยนแปลงโครงสร้างที่สำคัญเนื่องจากการหดตัวของซาร์โคเมียร์ สังเกตช่องว่างระหว่างไมโตคอนเดรีย

การถ่ายภาพของไมโทคอนเดรียในเส้นใยกล้ามเนื้อหัวใจที่ซึมผ่านได้ด้วยโพรบที่ไวต่อเมมเบรน teramethylrhodamine ethyl ether (TMRE) (A)เส้นใยที่มี 2mmoll -1 ATP, 2mmoll -1 malate และ 5mmoll -1 glutamate (ความเข้มข้นของ Ca 2+ อิสระในบัฟเฟอร์ Ca-EGTA: 0.1 μmoll -1 ) (B) เส้นใยชนิดเดียวกันหลังจากเติมแคลเซียมคลอไรด์ (ความเข้มข้นสุดท้ายของ Ca 2+ ฟรีในบัฟเฟอร์ Ca-EGTA: 1.0 μmoll -1 ) เส้นใยด้านซ้ายในห้อง flexiperm ไม่ได้รับการแก้ไข ในขณะที่เส้นใยด้านขวา (ยาวกว่า) ได้รับการแก้ไขที่ปลาย ใน A เส้นใยทั้งสองจะผ่อนคลาย ใน B เส้นใยด้านซ้ายหดตัว ในขณะที่เส้นใยด้านขวาซึ่งหดตัวเกือบจะมีมิติเท่ากัน แสดงให้เห็นถึงการเปลี่ยนแปลงโครงสร้างที่สำคัญเนื่องจากการหดตัวของซาร์โคเมียร์ สังเกตช่องว่างระหว่างไมโตคอนเดรีย

การถ่ายภาพของไมโทคอนเดรียในเส้นใยกล้ามเนื้อหัวใจที่ซึมผ่านได้หลังจากการสกัดไมโอซิน (เส้นใยผี) ด้วยโพรบที่ไวต่อเมมเบรน teramethylrhodamine ethyl ether (TMRE) (A) เส้นใยโกสต์ต่อหน้า 2mmoll -1 ATP, 2mmoll -1 malate และ 5mmoll -1 glutamate (ความเข้มข้นของ Ca 2+ อิสระในบัฟเฟอร์ Ca-EGTA: 0.1μmoll -1 ) (B) เส้นใยผีเดียวกันหลังจากเติมแคลเซียมคลอไรด์ (ความเข้มข้นสุดท้ายของ Ca 2+ ฟรีในบัฟเฟอร์ Ca-EGTA: 1.0μmoll -1 ) ไม่เห็นการเปลี่ยนแปลงโครงสร้าง ได้ผลลัพธ์เดียวกันสำหรับความเข้มข้นของ Ca 2+ ฟรี 3μmoll -1 .

การถ่ายภาพของไมโทคอนเดรียในเส้นใยกล้ามเนื้อหัวใจที่ซึมผ่านได้หลังจากการสกัดไมโอซิน (เส้นใยผี) ด้วยโพรบที่ไวต่อเมมเบรน teramethylrhodamine ethyl ether (TMRE) (A) เส้นใยโกสต์ต่อหน้า 2mmoll -1 ATP, 2mmoll -1 malate และ 5mmoll -1 glutamate (ความเข้มข้นของ Ca 2+ อิสระในบัฟเฟอร์ Ca-EGTA: 0.1μmoll -1 ) (B) เส้นใยผีเดียวกันหลังจากเติมแคลเซียมคลอไรด์ (ความเข้มข้นสุดท้ายของ Ca 2+ ฟรีในบัฟเฟอร์ Ca-EGTA: 1.0μmoll -1 ) ไม่เห็นการเปลี่ยนแปลงโครงสร้าง ได้ผลลัพธ์เดียวกันสำหรับความเข้มข้นของ Ca 2+ ฟรี 3μmoll -1 .

ผลของความเข้มข้นของ Ca 2+ ฟรีที่แตกต่างกันต่อพารามิเตอร์ของจลนพลศาสตร์ของ ADP ของการหายใจแบบไมโตคอนเดรียในเส้นใยกล้ามเนื้อหัวใจที่ซึมผ่านได้และในเส้นใยที่สกัดด้วยไมโอซิน (ผี) (A) ผลของ Ca 2+ ต่อปรากฏการณ์ KNS สำหรับ ADP ลดลงอย่างมากอย่างเห็นได้ชัด KNS สำหรับ ADP ถูกสังเกตพบในเส้นใยควบคุม ตรงกันข้ามไม่มีการเปลี่ยนแปลงที่ชัดเจน KNS สำหรับ ADP สามารถเห็นได้ในเส้นใยผี (B) ผลของความเข้มข้นของ Ca 2+ อิสระที่แตกต่างกันต่อ วีmax.

ผลของความเข้มข้นของ Ca 2+ ฟรีที่แตกต่างกันต่อพารามิเตอร์ของจลนพลศาสตร์ของ ADP ของการหายใจแบบไมโตคอนเดรียในเส้นใยกล้ามเนื้อหัวใจที่ซึมผ่านได้และในเส้นใยที่สกัดด้วยไมโอซิน (ผี) (A) ผลของ Ca 2+ ต่อปรากฏการณ์ KNS สำหรับ ADP ลดลงอย่างมากอย่างเห็นได้ชัด KNS สำหรับ ADP ถูกสังเกตพบในเส้นใยควบคุม ตรงกันข้ามไม่มีการเปลี่ยนแปลงที่ชัดเจน KNS สำหรับ ADP สามารถเห็นได้ในเส้นใยผี (B) ผลของความเข้มข้นของ Ca 2+ อิสระที่แตกต่างกันต่อ วีmax.

การสกัดไมโอซินช่วยป้องกันการเปลี่ยนแปลงโครงสร้างที่เกิดจาก Ca 2+ (รูปที่ 7) การกำจัด myosin ในสัดส่วนที่มีนัยสำคัญทำให้กิจกรรม MgATPase ทั้งหมดของเส้นใยลดลง (วัดเมื่อมี 3mmoll -1 MgATP) จากประมาณ 4.5–5.0nmol/minmg -1 มวลเปียก (มวลเริ่มต้น) เป็น 0.9–1.0nmol/minmg -1 เปียก ในเส้นใยผี การจัดเรียงตัวของไมโตคอนเดรียอย่างสม่ำเสมอโดยมีการตรึงขนานกันอย่างแม่นยำใน yz ระนาบของเซลล์ถูกสังเกต (ทิศทางของการวางแนวเส้นใยตั้งฉากกับ NS-axis) ทำให้เกิดรูปแบบลายเส้นสำหรับการกระจายไมโตคอนเดรียภายในเซลล์ ในเส้นใยผีเหล่านี้ ระยะห่างปกติระหว่างไมโตคอนเดรียซึ่งสอดคล้องกับความยาวของซาร์โคเมียร์จะไม่เปลี่ยนแปลงเมื่อความเข้มข้นของแคลเซียมเปลี่ยนแปลง (รูปที่ 7) ดังนั้นจึงไม่มีการเสียรูปของโครงสร้างภายในที่ปรับเปลี่ยนของ ICEUs ในเซลล์

รูปที่ 8 แสดงให้เห็นว่าเห็นได้ชัดเจนอย่างน่าประหลาดใจ KNS สำหรับ ADP จากภายนอกในการควบคุมการหายใจของไมโตคอนเดรียในเส้นใยที่ซึมผ่านได้เหมือนเดิมจะลดลงจาก 350 μmoll -1 เป็น 30 μmoll -1 โดยที่ความเข้มข้นของแคลเซียมอิสระสูงขึ้นเป็น 3 μmoll -1 และการเปลี่ยนรูปของโครงสร้างเซลล์ (รูปที่ 8A) ลดลงใน วีmax ของการหายใจยังสังเกตพบ (รูปที่ 8B) ไม่พบการเปลี่ยนแปลงเหล่านี้ในเส้นใยผี แม้จะมีการกำจัด myosin และกิจกรรม MgATPase โดยรวมลดลง 5 เท่า แต่ความชัดเจน KNS สำหรับ ADP จากภายนอก (349±34 μmoll -1 ) เริ่มต้น (ที่ความเข้มข้นของแคลเซียมอิสระ 0.1 μmoll -1) เท่ากับเส้นใยที่ซึมผ่านได้ครบถ้วนและคงอยู่เหนือ 250μmoll -1 เสมอ แม้ว่าความเข้มข้นของ Ca 2+ อิสระจะเพิ่มขึ้นเป็น 3 μmoll -1 (รูปที่ 8A) วีmax ไม่เปลี่ยนแปลงทั้งกับการเปลี่ยนแปลงของความเข้มข้นของ Ca 2+ อิสระ (รูปที่ 8B เมื่อเปรียบเทียบกับเส้นใยที่ผ่านการซึมผ่านที่ไม่เสียหาย วีmax เพิ่มขึ้นในเส้นใยผีเนื่องจากการสกัดโปรตีนในสัดส่วนที่มาก เช่น ไมโอซิน) ความคงตัวของการทำงานของไมโตคอนเดรียทั้งหมดในเส้นใยผีแสดงให้เห็นว่าการเปลี่ยนแปลงในความเข้มข้นของ Ca 2+ อิสระในช่วงที่ใช้ไม่ได้เปลี่ยนแปลงไมโตคอนเดรีย ซึ่งอาจเป็นผลมาจากกลไกการเปิดรูพรุนการเปลี่ยนแปลงการซึมผ่าน (PTP) (Lemasters et al., 1998 ).

ข้อสรุปที่สำคัญจากข้อมูลเหล่านี้ดูเหมือนจะเป็นความเชื่อมโยงโดยตรงระหว่างโครงสร้างและหน้าที่ระหว่างโครงสร้างซาร์โคเมียร์และฟังก์ชันไมโตคอนเดรีย ซึ่งสอดคล้องกับแนวคิดของ ICEU


ผลลัพธ์

แมสสเปกโตรเมทรีและในการวิเคราะห์ซิลิโกของโปรตีโอมไมโตคอนเดรียไม่ได้ตรวจสอบการมีอยู่ของ RAS ของไมโตคอนเดรีย

อันดับแรก เพื่อให้ได้หลักฐานที่เป็นกลางสำหรับการมีอยู่ของ RAS ในไมโตคอนเดรีย เราใช้เศษส่วนของยลที่บริสุทธิ์สำหรับการวิเคราะห์โปรตีโอมิก เศษส่วนของไมโทคอนเดรียดิบ (CM) พร้อมด้วยนิวเคลียส ไมโครโซม ไลโซโซม และไซโทพลาซึมถูกทำให้บริสุทธิ์โดยการหมุนเหวี่ยงแบบดิฟเฟอเรนเชียล จากเศษส่วน CM ไมโทคอนเดรียบริสุทธิ์ (PM) ถูกแยกออกจากเยื่อหุ้มที่เกี่ยวข้องกับไมโตคอนเดรีย (MAM) โดยใช้การหมุนเหวี่ยงด้วยความเข้มข้นสูงแบบไอโซปิกนิกบนเกรเดียนต์ความหนาแน่น Percoll ที่ก่อตัวขึ้นเองจากตับของหนูแรท 24 เศษส่วน MAM แสดงถึงส่วนต่อประสานของไมโตคอนเดรียกับออร์แกเนลล์เซลล์อื่น ๆ โดยเฉพาะอย่างยิ่งเอนโดพลาสมิกเรติคิวลัม (ER) ซึ่งมีปฏิสัมพันธ์การส่งสัญญาณและการเผาผลาญ จึงมีส่วนประกอบของ OMM และเยื่อหุ้มเซลล์อื่นๆ ที่เกี่ยวข้องอย่างหลวมๆ ในทางตรงกันข้าม ไมโทคอนเดรียบริสุทธิ์จะปราศจากออร์แกเนลล์อื่นๆ และอุดมไปด้วยเมทริกซ์, IMM, OMM และส่วนประกอบช่องว่างระหว่างเยื่อหุ้มเซลล์ (สำหรับบทวิจารณ์ล่าสุด ดู 25 ,26 ) โปรตีนจากเศษส่วนของ CM, PM และ MAM ถูกแยกโดย SDS-PAGE และอยู่ภายใต้การวิเคราะห์แมสสเปกโตรเมทรี (รูปที่ S1 เสริมและชุดข้อมูลเสริม S1) เรารวบรวมรายชื่อยีนที่เกี่ยวข้องกับ RAS โดยใช้ฐานข้อมูลยีนออนโทโลจี AmiGO (GO) และค้นหาการมีอยู่ของผลิตภัณฑ์การถอดความของยีนเหล่านี้ในกลุ่มที่ระบุโดยการวิเคราะห์แมสสเปกโตรเมทรี ที่สำคัญ จากส่วนประกอบที่เกี่ยวข้องกับ RAS สามส่วนที่พบในเศษส่วน CM และ MAM และ PM ไม่มีส่วนประกอบใดที่เกี่ยวข้องโดยตรงในการสร้างและผูกมัด angiotensin (ดูชุดข้อมูลเสริม S1)

ความถูกต้องของการค้นพบนี้ได้รับการสนับสนุนโดยการสอบปากคำของแค็ตตาล็อกที่เป็นกลางของโปรตีโอมไมโตคอนเดรีย ฐานข้อมูล MitoMiner รวบรวมการค้นพบจากการสำรวจโปรตีโอมิก 47 ครั้งจากหลายสายพันธุ์ 27 ในขณะที่ MitoCarta รวมโปรตีโอมิกส์ การถ่ายภาพ และการวิเคราะห์ลำดับเพื่อให้คะแนนความน่าจะเป็นของการแปลโปรตีนแต่ละตัวในมนุษย์และหนูเมาส์ เพิ่มความไวต่อการระบุโปรตีนของไมโตคอนเดรีย 28 นอกเหนือจากการวิเคราะห์โปรตีนในตับของหนูแล้ว การใช้ฐานข้อมูลเหล่านี้ทำให้เราสามารถทดสอบการมีอยู่ของส่วนประกอบ RAS และยีนที่เกี่ยวข้องทั้งหมดจากชุดของสายพันธุ์และเนื้อเยื่อของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม รวมถึงชุดยีนของหนู วัว และมนุษย์ (ชุดข้อมูลเสริม S2) . อีกครั้ง เราสร้างชุดยีนจากเงื่อนไข GO ที่เกี่ยวข้องกับ RAS ทั้งหมดในฐานข้อมูล AmiGO ในทุกสปีชีส์ จากนั้นเราค้นหายีน mitochondrial ที่คาดการณ์ไว้ในฐานข้อมูล MitoMiner และ MitoCarta สิ่งนี้เผยให้เห็นการแปลตำแหน่งไมโตคอนเดรียของผลิตภัณฑ์ยีนที่เกี่ยวข้องกับการสังเคราะห์อัลโดสเตอโรนเป็นเป้าหมายของ RAS แต่ไม่มีส่วนประกอบ RAS ที่แท้จริงที่ได้รับการพิสูจน์ในการทดลองหรือได้รับการทำนายทางชีวสารสนเทศเพื่อกำหนดตำแหน่งเป็นไมโตคอนเดรีย (ชุดข้อมูลเสริม S2)

ในขณะที่วิธีการเหล่านี้ร่วมกันทำให้การปรากฏตัวของ RAS ในไมโตคอนเดรียไม่น่าเป็นไปได้ แต่ก็ไม่สามารถแยกความเป็นไปได้ของการมีอยู่ของส่วนประกอบที่มีความอุดมสมบูรณ์ต่ำอย่างเป็นทางการ ดังนั้นเราจึงดำเนินการวิเคราะห์เศษส่วนย่อยของไมโตคอนเดรียที่บริสุทธิ์สำหรับการมีอยู่ของส่วนประกอบ RAS หลักโดยใช้อิมมูโนพรีซิพิเทชั่นและอิมมูโนบล็อตติง

ไมโทคอนเดรียในตับของหนูไม่มีสาร ACE . ที่ตรวจพบได้

หากมี RAS ที่ใช้งานได้และเพียงพอในไมโตคอนเดรีย ก็ควรมีเอ็นไซม์ที่สร้าง AngII ซึ่งเป็นหน้าที่ส่วนใหญ่เติมเต็มโดย ACE ซึ่งเป็นเอ็นไซม์ที่อนุรักษ์วิวัฒนาการได้มากที่สุด ซึ่งมีหน้าที่โดยตรงในการสร้าง AngII จาก AngI ทั่วร่างกาย ดังนั้นเราจึงพยายามระบุ ACE ในไมโตคอนเดรียที่บริสุทธิ์จากเนื้อเยื่อตับของหนู ดังแสดงในรูปที่ 1A แอนติบอดีที่ส่งตรงไปยังปลาย C ของโปรตีนรู้จักแถบน้ำหนักโมเลกุลสูง (MW ≈ 150 kDa, ทำนาย MW ของ ACE) ในเศษส่วนที่เป็นเนื้อเดียวกัน, นิวเคลียร์, ไลโซโซมและไมโครโซม แต่ ไม่ได้อยู่ในไมโตคอนเดรีย ในทางกลับกัน แถบ MW ต่ำ (� kDa) ถูกทำให้สมบูรณ์ในเศษส่วนของไมโตคอนเดรียที่ยังไม่ผ่านกระบวนการใดๆ แถบนี้ยังมีอยู่ในเศษส่วนของไมโตคอนเดรียบริสุทธิ์จากการเตรียมการที่เป็นอิสระสามชนิด แม้ว่าจะมีความเข้มต่ำและแปรผัน เนื่องจากมีไอโซฟอร์ม ACE ของมนุษย์และหนูที่สั้นกว่า (ACE-T, Uniprot <"type":"entrez-protein","attrs":<"text":"P47820","term_id":"1351843","term_text ":"P47820">> P47820) เราพยายามยืนยันตัวตนของแถบไมโตคอนเดรีย MW ที่ต่ำกว่า ดังนั้นเราจึงทำให้บริสุทธิ์โดยการกระตุ้นภูมิคุ้มกัน ( รูปที่ 1B ) และวิเคราะห์โดยแมสสเปกโตรเมทรี อย่างไรก็ตาม ผลลัพธ์ของการวิเคราะห์ไม่ได้ส่งคืนลำดับที่เกี่ยวข้องกับ ACE ซึ่งบ่งชี้ว่าแถบแสดงแทนการจับที่ไม่จำเพาะโดยแอนติบอดี ผลลัพธ์ทั้งหมดนี้ยืนยันการวิเคราะห์โปรตีโอมิกโดยไม่รวม ACE ในไมโตคอนเดรีย

(NS). Western blot ใช้แอนติบอดีต่อต้าน ACE และ anti-grp75 จากเศษส่วนย่อยเซลล์ตับของหนู H-โฮโมจิเนต, เศษส่วนนิวเคลียร์ N, C-cytosol, L-lysosomes, Mc-microsomes ไมโตคอนเดรียในตับของหนูถูกทำให้บริสุทธิ์โดยการหมุนเหวี่ยงแบบดิฟเฟอเรนเชียลเพื่อให้ได้ไมโตคอนเดรียแบบหยาบ (CM) และแยกเพิ่มเติมไปยังเยื่อหุ้มที่เกี่ยวข้องกับไมโทคอนเดรีย (MAM) และเศษส่วนไมโตคอนเดรียบริสุทธิ์ (PM) โดยการปั่นแยกไอโซปิก Percoll (สำหรับรายละเอียด ดูวิธีการ) เศษส่วนของไมโตคอนเดรียมีเพียงแถบอิมมูโนรีแอคทีฟ 50 kDa ที่ไม่ใช่แบบบัญญัติ รูปภาพของอิมมูโนบล็อตถูกครอบตัดเพื่ออธิบายบริเวณที่สนใจ สำหรับอิมมูโนบลอตสองส่วนที่แตกต่างกันของตัวอย่างเดียวกันถูกโหลดและแยกออกภายใต้สภาวะที่เหมือนกันดูภาพเต็มได้ที่รูปเสริม S3 (NS). การกระตุ้นภูมิคุ้มกันของ ACE โดยใช้เศษส่วน CM เป็นอินพุตโดยใช้วิธี Pierce Crosslink IP ตามที่อธิบายไว้ในวิธีการ 10 μg ACE C-20 แอนติบอดีถูกเชื่อมขวางกับโปรตีน A/G agarose resin และโปรตีน 1&#xx02005mg ถูกใช้เป็นอินพุต การตกตะกอนของภูมิคุ้มกันได้ดำเนินการใน Tris-Buffered Saline (TBS, 0.025 M Tris, 0.15 M NaCl pH 7.2) หรือ TBS ที่เสริมด้วย 0.5 mM EDTA, 0.5% NP-40, 2.5% กลีเซอรอลเพื่อส่งเสริม ACE การผูกมัด (D) แอนติบอดีแพะที่ไม่เกี่ยวข้อง (UR) และเรซินที่ไม่มีแอนติบอดีเชื่อมขวาง (R) ถูกใช้เป็นตัวควบคุมทั้งในสารละลาย TBS และ D แผงด้านบนแสดงการตรวจหาภูมิคุ้มกันโดยใช้แอนติบอดี ACE เดียวกัน แผงด้านล่างแสดงเจล SDS-PA ที่ย้อมสีเงิน แถบ 50 kDa ในส่วนเศษของ ACE-D ได้รับการวิเคราะห์โดยแมสสเปกโตรเมทรี และระบุว่าเป็นโปรตีนที่ไม่เกี่ยวข้องกับ ACE หรือ RAS รูปภาพถูกครอบตัดเพื่อแสดงแถบที่มองเห็นได้ทั้งหมด

ที่1R มีอยู่ใน MAM แต่ไม่มี AT1หนู2การผูก R หรือ AngII ตรวจพบได้ในเศษส่วน PM

แม้ว่าผลลัพธ์ก่อนหน้านี้จะไม่รวมความเป็นไปได้ของการสร้าง AngII ภายในไมโตคอนเดรียโดย ACE แต่ไมโตคอนเดรียยังคงเป็นเป้าหมายของ AngII ที่สร้างขึ้นที่ไซต์ภายในเซลล์อื่นๆ หรือนำเข้าจากแหล่งภายนอกเซลล์ ดังนั้นเราจึงค้นหาการมีอยู่ของตัวรับ AngII ที่ใช้งานได้ในเศษส่วนย่อยของเซลล์ตับของหนูและเซลล์ subchochondrial โดยใช้สองกลยุทธ์ที่เป็นอิสระ อันดับแรก เราวัดการผูกเฉพาะของ [ 125 I] -AngII ในเศษส่วน PM และ MAM ดังแสดงในรูปที่ 2A เราตรวจพบไซต์การจับที่มีความสัมพันธ์สูงเพียงจุดเดียวในเศษส่วนของ MAM ตามที่ระบุโดยเนินเขาที่มีความลาดชันใกล้กับเอกภาพโดยมีค่าคงที่การแยกตัวของสมดุล subnanomolar (KNS) และความหนาแน่นของตัวรับสูงสุด (Bmax) เทียบได้กับช่วงที่พบในพลาสมาเมมเบรน 29 ซึ่งบ่งชี้ว่าตำแหน่งการจับของ AngII ที่ใช้งานได้มีอยู่ในเยื่อหุ้มที่เกี่ยวข้องกับไมโตคอนเดรีย อย่างไรก็ตาม ตำแหน่งการจับที่มีสัมพรรคภาพสูงเดียวกันนั้นแสดง ≈ ความหนาแน่นน้อยกว่า 50 เท่าในไมโตคอนเดรียที่ถูกทำให้บริสุทธิ์ ซึ่งมีแนวโน้มมากที่สุดที่บ่งชี้การปนเปื้อนจากเศษส่วน MAM และไม่น่าจะสอดคล้องกับการส่งสัญญาณที่เป็นสื่อกลางของ AngII อย่างมีประสิทธิภาพ การผูกมัดของ AngII กับตำแหน่งการยึดเกาะของ MAM ถูกยับยั้งโดย AT . จำเพาะ1R ศัตรู Losartan แต่ไม่ได้รับผลกระทบจากAT2R antagonist PD123319 ซึ่งบ่งชี้ว่าการจับเป็นAT1ที่เกี่ยวข้องกับ R ( รูปที่ 2B )

(NS). ความใกล้ชิด (KNS) ความหนาแน่น (BMAX) และความร่วมมือ (ค่าสัมประสิทธิ์เนินเขา nH) ของไซต์ที่มีผลผูกพัน AngII เฉพาะในเศษส่วน PM และ MAM (NS). การจับเฉพาะของ [ 125 I] -AngII ในส่วน MAM ต่อหน้า AT1R (ยาโลซาร์แทน) หรือ AT2ตัวบล็อก R (PD123319) ความเข้มข้นของยาโลซาร์แทนคำนวณจากค่าคงที่การยับยั้ง 29 เพื่อสกัดกั้น 㺕% ของตัวรับ AT1 แต่ ς% ของ AT2R. [PD123319] ถูกคำนวณเพื่อป้องกัน 99% ของ AT2R แต่ ς% ของ AT1ร. (ค). การตรวจจับแบบ Western blot ของ AT1R ในเศษส่วนย่อยเซลล์ H-โฮโมจิเนต, C-cytosol, L-lysosomes, Mc-microsomes ไมโตคอนเดรียในตับของหนูถูกทำให้บริสุทธิ์โดยการปั่นเหวี่ยงแบบดิฟเฟอเรนเชียล (CM) และแยกเพิ่มเติมไปยังเยื่อหุ้มที่เกี่ยวข้องกับไมโทคอนเดรีย (MAM) และเศษส่วนของไมโตคอนเดรียบริสุทธิ์ (PM) โดยการปั่นเหวี่ยง Percoll แบบไอโซปิกนิก (สำหรับรายละเอียด ดูวิธีการ) Cytochrome oxidase subunit IV (CoxIV) ถูกใช้เป็นเครื่องหมายของเยื่อหุ้มชั้นในของไมโตคอนเดรีย รูปภาพของอิมมูโนบล็อตถูกครอบตัดเพื่ออธิบายบริเวณที่สนใจ ใช้เมมเบรนเดียวกันสำหรับอิมมูโนบล็อกทั้งสอง ดูภาพเต็มได้ที่รูปเสริม S4

เพื่อวิเคราะห์การมีอยู่และการแปลของ AT . เพิ่มเติม1R และ AT2R subtypes ต่อไปเราทำการวิเคราะห์ Western blot ของเศษส่วนย่อยเซลล์ตับของหนูและ sub-mitochondrial ตามข้อตกลงกับการศึกษาที่มีผลผูกพัน เราสามารถตรวจจับ AT1R ในเศษส่วน CM และ MAM แต่ไม่ใช่ใน PM ( รูปที่ 2C ) ในทางตรงกันข้าม แอนติบอดีต่อต้าน AT2R ให้ชุดของแถบอิมมูโนรีแอคทีฟ ( รูปที่ 3A ) แม้ในช่วงน้ำหนักโมเลกุลที่คาดไว้ของตัวรับ (�� kD รูปที่ 3B ) ดังนั้นเราจึงปฏิบัติตามกลยุทธ์ที่ใช้ก่อนหน้านี้กับ ACE โดยใช้แอนติบอดีเพื่อสร้างภูมิคุ้มกันให้กับพันธมิตรที่มีผลผูกพันและระบุโปรตีนที่เป็นผลลัพธ์โดยแมสสเปกโตรเมตรี การสร้างภูมิคุ้มกันด้วย anti-AT2แอนติบอดี R ดึงแถบสามแถบลงในช่วง 30� kD ใน MAM และส่วนหนึ่งในส่วนของ PM ( รูปที่ 3C ) อย่างไรก็ตาม แมสสเปกโตรเมทรีระบุว่าแถบเหล่านี้เป็นโปรตีนที่ไม่เกี่ยวข้องกัน

(NS). แถบภูมิคุ้มกันที่ตรวจพบโดย sc9040 กระต่าย AT2แอนติบอดี R ในส่วนย่อยเซลล์: H-homogenate, C-cytosol, L-lysosomes, Mc-microsomes ไมโตคอนเดรียในตับของหนูถูกทำให้บริสุทธิ์โดยการปั่นเหวี่ยงแบบดิฟเฟอเรนเชียล (CM) และแยกเพิ่มเติมไปยังเยื่อหุ้มที่เกี่ยวข้องกับไมโทคอนเดรีย (MAM) และเศษส่วนของไมโตคอนเดรียบริสุทธิ์ (PM) โดยการปั่นเหวี่ยง Percoll แบบไอโซปิกนิก (สำหรับรายละเอียด ดูวิธีการ) สำหรับ immunoblotting ใช้เมมเบรนชนิดเดียวกันดังในรูปที่ 2C รูปภาพถูกครอบตัดเพื่อแสดงแถบที่มองเห็นได้ทั้งหมด วงดนตรีที่ปรากฏ

15 kD แสดงถึงการย้อมสี CoxIV (NS). วิธีการนี้เผยให้เห็นแถบหลายแถบที่อยู่รอบน้ำหนักโมเลกุลที่คาดการณ์ไว้ของAT2อาร์ AT2แผง R ถูกครอบตัดจาก (A) Cytochrome oxidase subunit IV (CoxIV) ถูกใช้เป็นเครื่องหมายของเยื่อหุ้มชั้นในของไมโตคอนเดรีย อิมมูโนบล็อตจากเมมเบรนเดียวกันกับที่ใช้ใน (A) และรูปที่ 2C ภาพเต็มแสดงในรูปเสริม S4 (ค). ที่2R immunoprecipitation จากเศษส่วนย่อยของเซลล์และส่วนควบคุม IgG ทั้งหมดที่แยกจากกันโดย SDS PAGE และย้อมด้วย Coomassie-blue เพื่อรักษาความสมบูรณ์ของ IgG ที่ 130 kDa เราใช้บัฟเฟอร์การโหลด 4× ที่ไม่แปลงสภาพโดยไม่มีไดไทโอไทรอิทอลและ β-เมอร์แคปโตเอธานอล (200 nM Tris HCl pH 6.8, 8% SDS, 40% กลีเซอรอล, โบรโมฟีนอล 0.1% ). แถบกระตุ้นภูมิคุ้มกันสามแถบจากเศษส่วน MAM (วงกลมสีแดง) ได้รับการระบุโดยแมสสเปกโตรเมทรีว่าเป็นโปรตีนที่ไม่เกี่ยวข้องกับ RAS รูปภาพถูกครอบตัดเพื่อแสดงแถบทั้งหมด

ผลลัพธ์เหล่านี้ยืนยันการขาดตัวรับ AngII ที่ใช้งานได้ในไมโตคอนเดรียตับของหนู แต่เพิ่มความเป็นไปได้ที่ AngII ภายในเซลล์อาจเปลี่ยนแปลงการทำงานของไมโตคอนเดรียผ่านการกระทำของตัวเอกที่ตัวรับที่อยู่บน MAM ดังนั้นเราจึงทำการทดลองเพิ่มเติมโดยใช้ไมโทคอนเดรียที่ยังไม่บริสุทธิ์ (ซึ่งมีไมโตคอนเดรียบริสุทธิ์และเยื่อหุ้มที่เกี่ยวข้อง) และประเมินผลของ AngII ต่อปฏิกิริยาออกซิเดชันฟอสโฟรีเลชัน

AngII ออกแรงยับยั้งเล็กน้อยต่อการหายใจของไมโตคอนเดรียที่แยกได้ที่ความเข้มข้นเหนือสรีรวิทยา

ความเข้มข้นทางสรีรวิทยาของ AngII ในพลาสมาอยู่ในช่วงพิโคโมลาร์ ซึ่งสอดคล้องกับความสัมพันธ์ในระดับนาโนนาโนโมลาร์ของตัวรับแองจิโอเทนซินบนผิวเซลล์ เราได้พบ AT1Rs ที่มีความสัมพันธ์สูงเช่นเดียวกันในเศษส่วน MAM ระดับ AngII ของเนื้อเยื่อแตกต่างกันไปตั้งแต่พิโคโมลาร์ไปจนถึงช่วงนาโนโมลาร์ต่ำ ขึ้นอยู่กับประเภทเนื้อเยื่อและเงื่อนไข 30,31 ในขณะที่ยังไม่มีรายงานความเข้มข้นของ AngII ภายในเซลล์ ดังนั้นเราจึงวิเคราะห์ผลของ AngII ต่อไมโตคอนเดรียที่แยกได้ (เศษไมโทคอนเดรียดิบที่มีทั้งเศษส่วนย่อย PM และ MAM) ในช่วงความเข้มข้นกว้าง เหนือสรีรวิทยา (1 μM) ที่ทำให้ AngII อิ่มตัวไม่มีผลอย่างมีนัยสำคัญต่ออัตราการหายใจของไมโตคอนเดรียภายในฐาน (5 ถึง 25  นาทีในกรณีที่ไม่มีซับสเตรตภายนอกและ ADP) เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุม (รูปที่ 4A และรูปที่ S2) เพิ่มเติม ในทำนองเดียวกัน การเติม AngII แบบเฉียบพลันโดยใช้ความเข้มข้นในช่วงทางสรีรวิทยา (10� nM) ไม่มีผลต่อกิจกรรมของสารเชิงซ้อน I และ II ต่อหน้าพื้นผิวและ ADP (สถานะ 3 การหายใจ, รูปที่ 4B𠄽 ) สุดท้าย เราใช้ AngII ในช่วง 1 nM-1 μM เป็นเวลา 20  นาที และวัดสถานะ 3 กิจกรรมของคอมเพล็กซ์ I, II และ IV ( รูปที่ 4E–G ) อีกครั้ง AngII ไม่ได้ส่งผลกระทบอย่างมีนัยสำคัญต่อการหายใจเมื่อใช้ในช่วงทางสรีรวิทยา (1� nM) ในขณะที่ 1 μM AngII เหนี่ยวนำการลดลงเล็กน้อยแต่มีนัยสำคัญในคอมเพล็กซ์ I-, II และ IV ที่กระตุ้นโดย ADP สูงสุด - ขึ้นอยู่กับสถานะ 3 การหายใจ ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่า AngII ไม่ได้ให้ผลเฉพาะเจาะจงต่อปฏิกิริยาออกซิเดชันฟอสโฟรีเลชั่นในไมโตคอนเดรียที่แยกได้จากตับของหนู แต่อาจกำหนดเป้าหมายไปยังจุดจับที่ไม่จำเพาะที่ความเข้มข้นเหนือสรีรวิทยา

(NS). ปริมาณการใช้ออกซิเจนพื้นฐานในไมโทคอนเดรียตับหนูที่แยกได้ 5  นาทีหลังจากถ่ายโอนไปยังห้องหายใจ และที่ 5, 10, 15, 20 และ 25 นาทีหลังจากการเติม AngII (1 μM) (n = 18) (ข𠄽). การใช้ออกซิเจนที่เหนี่ยวนำโดย ADP ของไมโตคอนเดรียในตับของหนูที่แยกได้สำหรับสารเชิงซ้อน I และ II โดยมีและไม่มี (ควบคุม) การเติม AngII แบบเฉียบพลันที่ความเข้มข้นที่ระบุ ข้อมูลถูกสรุปบนแผง (B) (C) และ (D) แสดงการติดตามตัวแทนแต่ละรายจากการทดลอง 9 รายการจากการเตรียมการที่เป็นอิสระ 3 รายการ (เช่น–G). การใช้ออกซิเจนที่เหนี่ยวนำโดย ADP ของไมโทคอนเดรียในตับของหนูที่แยกได้สำหรับสารเชิงซ้อน I, II และ IV หลังจาก 20 นาทีของการฟักไข่โดยมีและไม่มี (ควบคุม) AngII เป็นเวลา 20  นาที (n = 9 (1� nM) n = 16 (1&# x02005μM)) ข้อมูลแสดงถึงค่าเฉลี่ย ±SEM การวิเคราะห์ทางสถิติ: สำหรับอัตราการหายใจพื้นฐาน ความแตกต่างตามเวลาระหว่างตัวอย่างได้รับการประเมินโดย ANOVA สำหรับการวัดซ้ำ (ปฏิกิริยาระหว่างกลุ่มเวลา: p > 0.05) สำหรับความแตกต่างของอัตราการหายใจที่กระตุ้นด้วย ADP ระหว่างตัวอย่างได้รับการประเมินโดยใช้การทดสอบตัวอย่างที่จับคู่ (* p < 0.05 AngII เทียบกับกลุ่มควบคุมสำหรับการเปรียบเทียบของสารเชิงซ้อน I, II และ IV)


นักวิจัยไขปริศนาไมโตคอนเดรียที่มีอายุหลายสิบปีที่อาจนำไปสู่การรักษาโรคใหม่

เครดิต: CC0 สาธารณสมบัติ

นักวิจัยของ Penn Medicine ได้ไขปริศนาเก่าแก่หลายทศวรรษเกี่ยวกับโมเลกุลสำคัญที่เติมเชื้อเพลิงให้กับโรงไฟฟ้าของเซลล์ ซึ่งสามารถนำไปใช้เพื่อหาวิธีใหม่ในการรักษาโรค ตั้งแต่ความผิดปกติของระบบประสาทไปจนถึงมะเร็ง

รายงานในการศึกษาใหม่ที่เผยแพร่ในวันนี้ใน ธรรมชาตินักวิจัยจากภาควิชาสรีรวิทยาในโรงเรียนแพทย์ Perelman แห่งมหาวิทยาลัยเพนซิลเวเนียและสถาบันอื่น ๆ พบว่ายีน SLC25A51 กำหนดการขนส่ง nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+) ซึ่งเป็นโคเอ็นไซม์พื้นฐานในการเผาผลาญของเซลล์ไปยังไมโตคอนเดรียซึ่งเป็นพลังงาน จากสารอาหารจะถูกแปลงเป็นพลังงานเคมีให้กับเซลล์ ระดับ NAD+ ที่ต่ำเป็นเครื่องหมายของความชราและมีความเกี่ยวข้องกับโรคต่างๆ รวมถึงการเสื่อมของกล้ามเนื้อและภาวะหัวใจล้มเหลว

"เราทราบมานานแล้วว่า NAD+ มีบทบาทสำคัญในไมโตคอนเดรีย แต่คำถามที่ว่าทำไมมันถึงอยู่ที่นั่นยังไม่ได้รับคำตอบ" Joseph A. Baur ผู้เขียนร่วมอาวุโสกล่าว รองศาสตราจารย์ด้านสรีรวิทยาและ สมาชิกของสถาบันเพนน์สำหรับโรคเบาหวาน โรคอ้วน และเมตาบอลิซึม "การค้นพบนี้เปิดพื้นที่การวิจัยใหม่ทั้งหมด ซึ่งเราสามารถจัดการได้จริง—ลดหรือเพิ่มแบบเลือกได้—NAD+ ที่ระดับเซลล์ย่อย ตอนนี้เรารู้แล้วว่ามันถูกขนส่งอย่างไร"

Xiaolu Ang Cambronne, Ph.D. ผู้ช่วยศาสตราจารย์ในภาควิชาชีววิทยาศาสตร์โมเลกุลในมหาวิทยาลัยเทกซัสออสติน ทำหน้าที่เป็นผู้เขียนร่วมอาวุโส

การค้นพบนี้ปิดความไม่รู้ที่มีมาช้านานเกี่ยวกับวิธีที่ NAD+ ค้นพบวิธีเข้าสู่เมทริกซ์ของไมโตคอนเดรีย มีการหมุนเวียนสมมติฐานหลายข้อ รวมถึงความคิดที่ว่าไมโทคอนเดรียของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมนั้นไม่สามารถขนส่ง NAD+ ได้ แทนที่จะอาศัยการสังเคราะห์ NAD+ ภายในออร์แกเนลล์ทั้งหมด แต่ในปี 2018 ห้องทดลองของ Baur ได้วางแนวคิดนั้นไว้เมื่อมีรายงานในการศึกษา eLife ว่าผู้ขนส่ง ในความเป็นจริงมีความรับผิดชอบ

จากที่นั่น ทีมวิจัยได้เริ่มค้นหาเอกลักษณ์ทางพันธุกรรมของผู้ขนส่ง NAD+ ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมในไมโตคอนเดรีย โดยอาศัยยีนหลายตัว รวมทั้ง SLC25A51 ที่คาดการณ์ว่าจะเป็นตัวขนส่ง แต่ยังไม่ทราบหน้าที่ สมาชิกครอบครัว SLC25A เข้ารหัสโปรตีนที่จำกัดตำแหน่งของไมโตคอนเดรียซึ่งนำพาวัสดุผ่านเยื่อหุ้มไมโตคอนเดรีย

"ในแนวทางของเรา เรามุ่งเน้นไปที่ยีนที่ถูกกำหนดให้เป็นสิ่งจำเป็นสำหรับความมีชีวิตของเซลล์ NAD+ เป็นโมเลกุลพื้นฐานที่จำเป็นสำหรับการรักษาการผลิตพลังงานที่อาศัยไมโตคอนเดรียเป็นสื่อกลาง เราคาดการณ์ว่าการสูญเสียการขนส่ง NAD+ ของไมโตคอนเดรียจะรบกวนฟอสโฟรีเลชั่นออกซิเดชันและอาจเป็นไปได้ ลดการอยู่รอดของเซลล์" ผู้เขียนนำ Timothy S. Luongo, Ph.D. , เพื่อนดุษฎีบัณฑิตในห้องปฏิบัติการ Baur กล่าว

ในการทดลองในห้องปฏิบัติการ นักวิจัยได้แยกไมโตคอนเดรียออกจากเซลล์ของมนุษย์และวัดระดับ NAD+ หลังจากเคาะ SLC25A51 หรือแสดงออกมากเกินไป การใช้ "ไบโอเซนเซอร์" ที่กำหนดเป้าหมายโดยไมโตคอนเดรีย แสดงให้เห็นว่าการเปลี่ยนแปลงในระดับการแสดงออกของยีนจะควบคุมระดับ NAD+ ของไมโตคอนเดรียโดยเฉพาะ

"เราสังเกตเห็นว่าการสูญเสียการแสดงออกของ SLC25A51 ได้เปลี่ยนแปลงความสามารถของไมโทคอนเดรียในการบริโภคออกซิเจนและสร้าง ATP รวมทั้งการขนส่ง NAD+ เข้าสู่เมทริกซ์ นอกจากนี้ ในความร่วมมือกับห้องปฏิบัติการ Cambronne เราสามารถแสดงให้เห็นว่าการแสดงออกของ SLC25A51 ในยีสต์ที่ขาด ตัวขนส่ง NAD+ ของไมโตคอนเดรียภายในได้ฟื้นฟูการขนส่งไมโตคอนเดรีย NAD+” Luongo กล่าว

ระดับ NAD+ สามารถกำหนดเป้าหมายได้ในการรักษาโรคต่างๆ อย่างไรก็ตาม ระดับ NAD+ สามารถกำหนดเป้าหมายได้ทั้งหมด โดยที่ระดับจะเพิ่มขึ้นหรือลดลงในทุกส่วนของเซลล์ ซึ่งเสี่ยงต่อการเปลี่ยนแปลงการแสดงออกของยีนหรือเมตาบอลิซึมประเภทอื่นๆ โดยไม่ได้ตั้งใจ . การศึกษานี้เป็นกรณีที่ตีพิมพ์ครั้งแรกซึ่งนักวิจัยระบุเป้าหมายเฉพาะและลดระดับในไมโตคอนเดรียเท่านั้นและไม่มีส่วนอื่นของเซลล์

การควบคุมระดับ NAD+ และกระบวนการเผาผลาญในไมโตคอนเดรียอาจมีนัยสำคัญต่อการศึกษาและพัฒนาวิธีการรักษาใหม่ๆ สำหรับโรคต่างๆ การเปิดใช้งานกลไกการขนส่งอาจทำให้เซลล์สนับสนุนสภาวะการหายใจเพื่อสร้างพลังงานแทนไกลโคไลซิส ตัวอย่างเช่น มะเร็งประเภทต่างๆ พึ่งพาไกลโคไลซิสเป็นอย่างมาก ดังนั้นการสร้างสภาพแวดล้อมที่ไม่เอื้ออำนวยโดยปราศจากการเผาผลาญนั้นอาจเป็นกลยุทธ์เดียว หรือในทางกลับกัน อาจเป็นไปได้ที่จะปฏิเสธเซลล์มะเร็งระบบทางเดินหายใจที่มีระดับ NAD+ มาก ดังนั้นพวกมันจึงถูกบังคับให้ต้องพึ่งพาไกลโคไลซิส หัวใจต้องการพลังงานที่ผลิตไมโตคอนเดรียในปริมาณมากเพื่อส่งเลือดไปยังเนื้อเยื่อส่วนปลายอย่างต่อเนื่อง สาเหตุหลักที่ทำให้เกิดภาวะหัวใจล้มเหลวคือความผิดปกติของไมโตคอนเดรีย ดังนั้นการกำหนดเป้าหมายความสามารถของไมโทคอนเดรียในการขนส่ง NAD+ อาจช่วยปรับปรุงการทำงานของหัวใจของหัวใจที่ล้มเหลว ในแง่ของการออกกำลังกาย

งานนี้อยู่ในช่วงเริ่มต้น แต่มีการเปิดประตูสำหรับการสืบสวนใหม่ที่มีศูนย์กลางอยู่ที่ NAD+ ของไมโตคอนเดรียและยีนนี้ ต่อไป นักวิจัยจะศึกษาหน้าที่ทางสรีรวิทยาของการขนส่ง NAD+ และวิธีควบคุมกลไกนี้ ตลอดจนวิธีการเปิดและปิดการขนส่งนอกเหนือจากการลดหรือเพิ่มการแสดงออกของยีน

Baur กล่าวว่า "แนวทางในการปรับเปลี่ยนกลุ่ม NAD + ของ mitochondrial โดยเฉพาะเป็นสิ่งที่นักวิจัยหลายคนกำลังมองหา ดังนั้นผมจึงคาดหวังว่าเราจะเห็นยีนนี้กำหนดเป้าหมายในหลายระบบ" "ฉันคิดว่านี่จะเป็นเครื่องมือที่มีค่าจริงๆ เพื่อช่วยให้เราเข้าใจการทำงานของ NAD+ ของไมโตคอนเดรียและศักยภาพในการรักษาได้ดีขึ้น"


ผลลัพธ์

ไม่พบความแตกต่างระหว่างตู้ฟักไข่สำหรับพารามิเตอร์ทั้งหมดที่วัด ดังนั้นข้อมูลจากตู้ฟัก A และ B จึงถูกรวมเข้าด้วยกัน

การหายใจของไมโตคอนเดรีย

สถานะ 3m

สำหรับสารเชิงซ้อนทั้งสองชนิด รัฐ 3m แสดงรูปแบบเดียวกันระหว่างไมโตไทป์สำหรับ 12°C, 18°C ​​และ 24°C (รูปที่ 2A,B) รวมทั้งอุณหภูมิสำหรับไมโทไทป์ทั้งสองชนิด มีความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญระหว่างสองไมโทไทป์ที่อุณหภูมิ 18°C ​​(NS=0.0168 สำหรับ pyruvate + malate + proline และ NS<0.0001 สำหรับ sn กลีเซอรอล-3-ฟอพเสต), ซิII สูงกว่า ซิสาม.

ซิII แสดงการเพิ่มขึ้นเล็กน้อยจาก 12°C เป็น 24°C โดยมีความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญระหว่าง 12°C และ 18°C ​​(NS-ค่า ≤0.0201 สำหรับสารเชิงซ้อนทั้งสองชนิด) และระหว่าง 18°C ​​ถึง 24°C (NS<0.0001 สำหรับคอมเพล็กซ์ทั้งสอง) เราตรวจพบการลดลงอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเปรียบเทียบ 28°C กับ 24°C (NS<0.0001 สำหรับไมโทไทป์ทั้งสองชนิด) สถานะ 3m ของคอมเพล็กซ์ III เพิ่มขึ้นอย่างเห็นได้ชัดจาก 18°C ​​เป็น 24°C (NS<0.0001) ขณะคงอุณหภูมิเท่าเดิมที่ 24°C และ 28°C (ซิII) หรือเพิ่มขึ้นเล็กน้อยสำหรับ ซิสาม (NS=0.0426).

รัฐ 4o

ซิII มีสถานะที่สูงกว่าอย่างมีนัยสำคัญ 4o than ซิIII ที่อุณหภูมิ 18°C ​​(NS≤0.0021 สำหรับสารเชิงซ้อนทั้งสองชนิด) และ 24°C (NS-ค่า ≤0.0123 สำหรับสารเชิงซ้อนทั้งสองชนิด) ในขณะที่ที่อุณหภูมิ 12°C และ 28°C มีค่าสูงกว่าอย่างมีนัยสำคัญสำหรับ ซิสาม (NS-ค่า ≤0.0497) แต่เฉพาะเมื่อมีการจัดเตรียมพื้นผิวให้กับสารเชิงซ้อน I (รูปที่ 2C,D)

นอกจากนี้เรายังสังเกตเห็นความแตกต่างที่มีนัยสำคัญระหว่าง 12°C และ 18°C ​​(คอมเพล็กซ์ I, NS<0.0001), 12°C และ 24°C (NS<0.0001 สำหรับสารเชิงซ้อนทั้งสองชนิด) และระหว่าง 18°C ​​ถึง 24°C (NS-ค่า ≤0.0011 สำหรับทั้งสองคอมเพล็กซ์) ใน ซิครั้งที่สอง ที่ 28°C มีการสังเกตการลดลงอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเปรียบเทียบกับ 24°C สำหรับสารเชิงซ้อน I in ซิครั้งที่สอง (NS=0.0002).

ใน ซิIII สถานะ 4o ของสารเชิงซ้อน I เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญจาก 12°C เป็น 28°C ในขณะที่ในเชิงซ้อน III ลดลงระหว่าง 12°C และ 18°C ​​(NS=0.0106) และเพิ่มขึ้นระหว่าง 18°C, 24°C และ 28°C (รูปที่ 2C,D)

อัตราส่วน ADP/O

เมื่อใช้วัสดุพิมพ์สำหรับคอมเพล็กซ์ I (รูปที่ 2E) มีความแตกต่างทางสถิติระหว่างสองบรรทัดที่ 12°C โดยมีอัตราส่วน ADP/O ที่สูงขึ้นสำหรับ ซิII ไมโทไทป์ (NS=0.0003). ท่ามกลางอุณหภูมิ ซิII และ ซิIII มีความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญ โดยมีอัตราส่วน ADP/O สูงกว่าที่ 24°C เมื่อเทียบกับ 12°C, 18°C ​​และ 28°C (ทั้งหมด NS-ค่า ≤0.0002)

สำหรับคอมเพล็กซ์ III (รูปที่ 2F) ความแตกต่างที่สำคัญเพียงอย่างเดียวระหว่างไมโตไทป์เกิดขึ้นที่ 28°C โดยมี ซิIII ต่ำกว่า (NS=0.0093) ท่ามกลางอุณหภูมิ ไม่พบความแตกต่างที่มีนัยสำคัญสำหรับ ซิII ในขณะที่ ซิIII แสดงการเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญที่ 18°C ​​และ 24°C เมื่อเทียบกับ 12°C (NS-ค่า ≤0.0054) และ 28°C (NS-ค่า ≤0.0026)

RCR และ UCR

ผลลัพธ์ของ RCRs แสดงไว้ในรูปที่ 3 การเปรียบเทียบระหว่างไมโทไทป์พบว่ามี RCR ที่สูงขึ้นอย่างมีนัยสำคัญสำหรับ ซิII ที่อุณหภูมิ 12°C ที่ระดับคอมเพล็กซ์ I (NS=0.0231) เช่นเดียวกับที่ 28°C ที่ระดับ III เชิงซ้อน (NS=0.0143) น่าแปลกที่ RCR ของ ซิII ต่ำกว่า .อย่างมีนัยสำคัญ ซิIII ที่อุณหภูมิ 24 องศาเซลเซียส (NS=0.0292) เมื่อเตรียมซับสเตรตให้กับสารเชิงซ้อน I

ในไมโตไทป์ทั้งสอง RCR ของคอมเพล็กซ์ I ไม่มีความแตกต่างระหว่าง 18°C ​​ถึง 28°C แต่ทั้งคู่มีค่าสูงกว่าอย่างมีนัยสำคัญที่ 12°C (NS-ค่า ≤0.0309 สำหรับไมโตไทป์ทั้งสองชนิด) และ 24°C (NS-ค่า ≤0.0139 สำหรับไมโตไทป์ทั้งสองชนิด) นอกจากนี้ RCR ที่อุณหภูมิ 12°C สูงกว่าที่ 24°C สำหรับ ซิครั้งที่สอง (NS=0.0238) ขณะที่เราสังเกตแนวโน้มตรงกันข้ามสำหรับ ซิสาม (NS=0.0043) เราสังเกตเห็นการเพิ่มขึ้นเล็กน้อยแต่มีนัยสำคัญจาก 12°C เป็น 28°C ที่ระดับ III เชิงซ้อน ผลลัพธ์ของ UCR แสดงไว้ในตารางที่ 2 ไม่พบความแตกต่างที่มีนัยสำคัญใน UCR ระหว่างสายพันธุ์หรือระหว่างอุณหภูมิ

การวัดด้วยเอนไซม์

ไม่พบความแตกต่างที่มีนัยสำคัญระหว่างไมโทไทป์ (รูปที่ 4A) ในกิจกรรม ACO ที่อุณหภูมิใดๆ แสดงว่าไม่มีความแตกต่างในความเครียดออกซิเดชันที่สนับสนุนโดยแต่ละสายเหล่านี้ อย่างน้อยก็ในไมโตคอนเดรีย สิ่งนี้สะท้อนให้เห็นจากการไม่มีความแตกต่างที่มีนัยสำคัญระหว่างไมโทไทป์ทั้งสองชนิดในระดับ MDA (ไม่แสดงข้อมูล)

การทำงานของไมโตคอนเดรียที่วัดที่อุณหภูมิที่แตกต่างกันสี่แบบในไมโตคอนเดรียที่แยกได้จากไมโตไทป์ทั้งสองของ แมลงหวี่ simulans NSผมII และ sผมสาม. สถานะการหายใจ 3 ด้วย (A) ซับสเตรต I เชิงซ้อน (ไพรูเวต + มาเลต + โพรลีน) และ (B) sn glycerol-3-phosphate สถานะ 4 การหายใจด้วยตัวยับยั้ง olygomycin ที่ระดับของ (C) คอมเพล็กซ์ I และ (D) คอมเพล็กซ์ III อัตราส่วน ADP/O ที่คำนวณจาก (E) คอมเพล็กซ์ I และ (F) คอมเพล็กซ์ III ผลลัพธ์หมายถึง ± s.d. สำหรับ 10 การเตรียมไมโตคอนเดรีย ความสำคัญถูกกำหนดเป็น NS<0.05 * หมายถึงความแตกต่างระหว่างตัวอักษรไมโตไทป์แสดงถึงความแตกต่างระหว่างอุณหภูมิโดยมีความแตกต่างทางสถิติจาก b และ c, b แตกต่างทางสถิติจาก c

การทำงานของไมโตคอนเดรียที่วัดที่อุณหภูมิที่แตกต่างกันสี่แบบในไมโตคอนเดรียที่แยกได้จากไมโตไทป์ทั้งสองของ แมลงหวี่ simulans NSผมII และ sผมสาม. สถานะการหายใจ 3 ด้วย (A) ซับสเตรต I เชิงซ้อน (ไพรูเวต + มาเลต + โพรลีน) และ (B) sn glycerol-3-phosphate State 4 การหายใจด้วยตัวยับยั้ง olygomycin ที่ระดับ (C) คอมเพล็กซ์ I และ (D) คอมเพล็กซ์ III อัตราส่วน ADP/O ที่คำนวณจาก (E) คอมเพล็กซ์ I และ (F) คอมเพล็กซ์ III ผลลัพธ์หมายถึง ± s.d. สำหรับ 10 การเตรียมไมโตคอนเดรีย ความสำคัญถูกกำหนดเป็น NS<0.05 * หมายถึงความแตกต่างระหว่างตัวอักษรไมโตไทป์แสดงถึงความแตกต่างระหว่างอุณหภูมิโดยมีความแตกต่างทางสถิติจาก b และ c, b แตกต่างทางสถิติจาก c

กิจกรรม COX สูงขึ้นอย่างมีนัยสำคัญสำหรับ ซิIII ที่อุณหภูมิ 12°C เท่านั้น (NS<0.0001 รูปที่ 4B) ยิ่งไปกว่านั้น เราสังเกตเห็นการเพิ่มขึ้นเล็กน้อยจาก 12°C เป็น 28°C สำหรับไมโทไทป์ทั้งสองชนิด โดยมีความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญระหว่าง 12°C, 18°C, 24°C และ 28°C

ที่ 18°C ​​กิจกรรม CAT สูงขึ้นใน ซิII เปรียบเทียบกับwi ซิสาม (NS=0.0116) ในขณะที่ที่ 28°C มันต่ำกว่า (NS=0.0005) (รูปที่ 4C)

COX ความจุส่วนเกินและการควบคุมการเผาผลาญฟลักซ์

กิจกรรม IV ที่ซับซ้อนและการหายใจของไมโตคอนเดรียด้วยไพรูเวต มาเลต แอล -โพรลีนและ sn กลีเซอรอล-3-ฟอสเฟตถูกยับยั้งโดยโซเดียมเอไซด์ เราตรวจสอบความจุส่วนเกินที่เห็นได้ชัดของ COX ที่ฟลักซ์สูงผ่าน ETS โดยใช้วัสดุพิมพ์ร่วมกันซึ่งลดสารเชิงซ้อน I และ III ได้มากที่สุด การไทเทรตอะไซด์ทำให้เกิดการยับยั้งไฮเปอร์โบลิกของ COX พล็อตธรณีประตูแสดงฟลักซ์ทางเดินเป็นฟังก์ชันของกิจกรรม COX ธรณีประตูสำหรับการยับยั้ง COX ถูกกำหนดให้เป็นจุดตัดของความชันเริ่มต้นที่มีความพอดีเชิงเส้นของความชันสุดท้าย (รูปที่ 5) ความจุส่วนเกินที่เห็นได้ชัดของ COX คือการสกัดกั้นของการอนุมานของการถดถอยเชิงเส้นสำหรับความชันขั้นสุดท้ายที่มีแกนที่การยับยั้ง COX เป็นศูนย์ เราตรวจพบเกณฑ์ ดังนั้น COX เกินความจุที่ 12°C โดยไม่มีความแตกต่างระหว่างสอง mitotypes (604%, NS 2 =0.9139 สำหรับ ซิครั้งที่สอง และ 613% NS 2 =0.9301 สำหรับ ซิสาม).

น่าแปลกที่อุณหภูมิที่เพิ่มขึ้น COX ความจุส่วนเกินหายไปและการเปรียบเทียบระหว่างความแตกต่าง Kผม และ ผม. เราสังเกตเพิ่มขึ้น Kผม ด้วยอุณหภูมิที่เพิ่มขึ้นแต่ไม่พบความแตกต่างระหว่างไมโทไทป์ (ตารางที่ 1)


ดูวิดีโอ: หายใจทางปาก. ปญหาทถกมองขาม. โบเวจา (สิงหาคม 2022).